發(fā)酵工程實驗

前言

　　發(fā)酵工程既是傳統(tǒng)的技術(shù)，又是長盛不衰的技術(shù)，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，人們對環(huán)境治理的重視和生物能源的開發(fā)，發(fā)酵工程的應(yīng)用越來越廣泛。隨著電子技術(shù)、信息技術(shù)、化學(xué)分析技術(shù)的進(jìn)展，發(fā)酵過程的研究也由傳統(tǒng)的胞外環(huán)境優(yōu)化發(fā)展到細(xì)胞水平、基因水平、工程水平的多參數(shù)多尺度研究。華東理工大學(xué)自1955年以來就開設(shè)了發(fā)酵工程實驗（當(dāng)時是抗生素專業(yè)實驗），歷經(jīng)幾十年的實踐，實驗內(nèi)容不斷更新，特別是1990年以后，我校承擔(dān)了大量的國家科研項目和企業(yè)委托的科研項目，積累了研究技術(shù)，所以我們一直打算寫一本關(guān)于實驗的書，一方面總結(jié)我們已有的實驗方法，為相關(guān)科研提供參考，另一方面也為需要尋找實驗內(nèi)容的學(xué)校提供方便。近年來設(shè)立生物工程、生物技術(shù)專業(yè)的學(xué)校越來越多，從20世紀(jì)90年代的30多所學(xué)校到現(xiàn)在的200多所學(xué)校，發(fā)酵工程實驗成為必修的實驗，我們希望這本書能為大家開設(shè)實驗提供素材，各?？梢愿鶕?jù)自己的專業(yè)特色選做其中合適的實驗。　　本教材包括3個部分：緒論、發(fā)酵工程基本實驗和綜合實驗。緒論部分主要介紹發(fā)酵實驗室的基本要求和設(shè)備（宮衡），統(tǒng)計學(xué)方法的實驗設(shè)計和數(shù)據(jù)處理（李友元）；基本實驗包括菌種改造（高淑紅），培養(yǎng)基配制與滅菌（宮衡），搖瓶發(fā)酵實驗（陳長華），發(fā)酵生化參數(shù)測定（陳長華），色譜分析在發(fā)酵工程中的應(yīng)用（李友元）及過程工程參數(shù)測定（夏杰）。基本實驗選擇的產(chǎn)品是一些典型的產(chǎn)品如抗生素、有機(jī)酸、氨基酸、重組蛋白表達(dá)產(chǎn)品等，檢測的參數(shù)有培養(yǎng)基中基質(zhì)、產(chǎn)物、酶，以及溶氧等動力學(xué)參數(shù)。綜合實驗部分選擇了13個實驗，涉及傳統(tǒng)微生物、重組微生物和動物細(xì)胞的培養(yǎng)。通過選做基本實驗培養(yǎng)學(xué)生的基本實驗技能，通過綜合實驗對學(xué)生進(jìn)行實驗設(shè)計和實驗全過程的訓(xùn)練。　　本書每一章都是首先講述原理，然后配有實驗，書中共有基本實驗70多個，綜合實驗13個。這些實驗都是我校幾十年來為本科生開設(shè)的實驗，以及研究生做論文時建立的實驗方法，有些是自己實踐的結(jié)果，少數(shù)是參考了兄弟院校的研究論文。實驗操作描述詳盡，便于學(xué)者實踐。不同的學(xué)?？梢愿鶕?jù)自身的要求選做實驗，研究生在進(jìn)行課題研究時也可以應(yīng)用書中方法來檢測很多代謝參數(shù)。我校很多老師參與了綜合實驗的編寫，如王永紅、蔡海波、徐國謙等，在此對他們表示感謝?！　∥覀兿Ｍ@本書能對讀者的科研或教學(xué)有所幫助，如有建議或問題歡迎指正。

內(nèi)容概要

　　與發(fā)酵工程理論課相配套的實驗教材。內(nèi)容包括3部分：緒論、發(fā)酵工程基本實驗和綜合實驗。緒論部分主要介紹發(fā)酵實驗室的基本要求和設(shè)備，統(tǒng)計學(xué)方法的實驗設(shè)計和數(shù)據(jù)處理?；緦嶒灠?部分：①菌種選育，介紹了4類常用的菌種選育方法：物理誘變、化學(xué)誘變、原生質(zhì)體融合和基因工程方法。②培養(yǎng)基配制與滅菌，介紹了微生物對營養(yǎng)的要求及常用的營養(yǎng)成分，培養(yǎng)基配制方法和注意事項。③搖瓶發(fā)酵，介紹了搖瓶發(fā)酵的基本操作，包括接種、移種、種子制備、發(fā)酵的單元操作技術(shù)。④發(fā)酵生化參數(shù)的檢測，介紹了發(fā)酵過程常規(guī)的參數(shù)檢測方法，如菌濃、基質(zhì)、產(chǎn)物濃度的檢測方法，同時還介紹了核酸、酶活、蛋白質(zhì)等反應(yīng)代謝的參數(shù)。⑤儀器分析，介紹了用氣相色譜儀、液相色譜儀等檢測代謝中間物的原理與方法。⑥過程工程參數(shù)檢測，主要是介紹反應(yīng)器中K1a、攪拌轉(zhuǎn)速、氧傳遞速率的檢測方法。綜合實驗是在基本實驗基礎(chǔ)上的提高，實驗既有發(fā)酵全過程的訓(xùn)練如培養(yǎng)、參數(shù)檢測、過程動力學(xué)分析的組合，也有內(nèi)容的拓展，如酶反應(yīng)、動物細(xì)胞培養(yǎng)等。本教材可作為生物工程專業(yè)、發(fā)酵工程專業(yè)本科生的實驗教材，也可以作為碩士和博士研究生實驗的參考教材。

書籍目錄

緒論一、發(fā)酵工程實驗的特點(diǎn)(一)發(fā)酵工程實驗的目的和要求(二)實驗室的一般要求二、發(fā)酵工程實驗室的特點(diǎn)與要求(一)發(fā)酵工程實驗的特點(diǎn)(二)發(fā)酵工程實驗的要求(三)發(fā)酵工程實驗室的安排三、發(fā)酵工程實驗設(shè)計(方案)的基本步驟(一)實驗設(shè)計(方案)的內(nèi)容及要求(二)實驗設(shè)計(方案)的擬定步驟(三)數(shù)據(jù)回歸分析四、發(fā)酵工程實驗常用的設(shè)備(一)搖瓶(二)搖床(三)發(fā)酵罐第一部分 基本技能實驗第一章 菌種改造第一節(jié) 菌種分離純化和自然選育第二節(jié) 微生物的誘變育種(一)誘變育種步驟(二)物理誘變與化學(xué)誘變第三節(jié) 富集培養(yǎng)技術(shù)在育種中的應(yīng)用(一)抗性突變株的富集(二)營養(yǎng)缺陷型的富集第四節(jié) 原生質(zhì)體育種(一)標(biāo)記菌株的篩選(二)原生質(zhì)體的制備(三)原生質(zhì)體的再生(四)原生質(zhì)體的融合(五)融合子的選擇實驗一 菌種的分離純化實驗二 紫外誘變實驗三 微波誘變實驗四 亞硝基胍誘變實驗五 噬菌體的分離和測定實驗六 抗噬菌體菌種選育實驗七 氨基酸抗反饋調(diào)節(jié)突變株的選育實驗八 大腸桿菌營養(yǎng)缺陷型的篩選實驗九 原生質(zhì)體制備及再生實驗十 原生質(zhì)體融合第五節(jié) 基因組改組技術(shù)第六節(jié) 微生物基因工程技術(shù)及其在微生物種中的應(yīng)用(一)目的基因的獲取(二)克隆載體的選擇與構(gòu)建(三)外源基因與載體的連接(四)重組DNA導(dǎo)人受體細(xì)胞(五)重組體的篩選(六)克隆基因的表達(dá)(七)PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因?qū)嶒炇?基因組改組技術(shù)篩選蛋白酶高產(chǎn)菌株實驗十二 基因組DNA的提取實驗十三 煮沸法快速提取質(zhì)粒DNA實驗十四 堿裂解法抽提質(zhì)粒DNA與鑒定實驗十五 DNA的限制性內(nèi)切酶消化實驗十六 瓊脂糖電泳檢測DNA實驗十七 PCR技術(shù)擴(kuò)增枯草桿菌deoD基因?qū)嶒炇?重組T質(zhì)粒的構(gòu)建實驗十九 感受態(tài)的制備和轉(zhuǎn)化實驗二十 重組質(zhì)粒的鑒定——菌落PCR第二章 培養(yǎng)基配制與滅菌第一節(jié) 培養(yǎng)基的配制(一)微生物的營養(yǎng)需求及對物質(zhì)的吸收(二)培養(yǎng)基(三)培養(yǎng)基的配制第二節(jié) 高壓蒸汽滅菌(一)滅菌與消毒的基本概念(二)高壓蒸汽滅菌的原理(三)高壓滅菌設(shè)備實驗二十一 培養(yǎng)基的配制實驗二十二 高壓滅菌鍋的使用第三章 搖瓶發(fā)酵第一節(jié) 發(fā)酵原理(一)營養(yǎng)(二)溫度(三)pH(四)溶氧第二節(jié) 搖瓶發(fā)酵實驗實驗二十三 接種工具的認(rèn)識與滅菌實驗二十四 接種和移種實驗二十五 枯草芽孢桿菌生產(chǎn)腺苷實驗二十六 重組大腸桿菌羧肽酶的表達(dá)實驗二十七 洛伐他汀發(fā)酵實驗二十八 林可霉素發(fā)酵實驗二十九 四環(huán)素類抗生素定向發(fā)酵實驗三十 半乳糖苷酶生成的調(diào)節(jié)實驗三十一 芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)堿性蛋白酶第四章 發(fā)酵生化參數(shù)的測定第一節(jié) 生化參數(shù)測定原理第二節(jié) 生化參數(shù)分析方法實驗三十二 比濁法測定發(fā)酵液中大腸桿菌濃度實驗三十三 測定菌體干重實驗三十四 紫外分光光度法定量測定細(xì)胞總核酸實驗三十五 紅霉素效價的化學(xué)法測定一實驗三十六 紅霉素效價的化學(xué)法測定二實驗三十七 紅霉素生物效價的測定實驗三十八 二劑量法測定林可霉素生物效價實驗三十九 利福霉素化學(xué)效價的測定實驗四十 檸檬酸含量測定一實驗四十一 檸檬酸含量測定二實驗四十二 衣康酸含量測定實驗四十三 丙酮酸含量測定實驗四十四 用SBA－40C型生物傳感分析儀測定谷氨酸和谷氨酰胺實驗四十五 華勃氏呼吸儀測定谷氨酸的量實驗四十六 雙縮脲法測定蛋白質(zhì)含量實驗四十七 Folin－酚法測定蛋白質(zhì)濃度實驗四十八 考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)濃度實驗四十九 SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)檢測蛋白表達(dá)和測定蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量實驗五十 發(fā)酵液中糖含量的測定實驗五十一 DNS法測定還原糖濃度實驗五十二 酶試劑盒法測定葡萄糖含量實驗五十三 SBA－40型谷氨酸(乳酸)－葡萄糖雙功能分析儀測定葡萄糖含量實驗五十四 發(fā)酵液氮含量的測定實驗五十五 靛酚藍(lán)法測定銨離子實驗五十六 鉬酸銨法測定無機(jī)磷實驗五十七 還原法測定無機(jī)磷實驗五十八 鉬釩法測定無機(jī)磷實驗五十九 無細(xì)胞抽提液的制備實驗六十 葡萄糖激酶的酶活測定實驗六十一 磷酸果糖激酶的測定實驗六十二 異檸檬酸脫氫酶活力測定實驗六十三 6－磷酸葡萄糖脫氫酶的測定實驗六十四 丙酮酸激酶活力測定實驗六十五 檸檬酸合成酶活力測定實驗六十六 堿性磷酸酶(AKP)酶活測定實驗六十七 脂肪酶活力測定實驗六十八 堿性蛋白酶活力測定實驗六十九 ?；っ富盍Φ臏y定實驗七十 ?；鵆oA合成酶活力的測定第五章 色譜分析在發(fā)酵工程中的應(yīng)用第一節(jié) 色譜分析概述(一)氣相色譜法的特點(diǎn)(二)氣相色譜分離條件的選擇(三)液相色譜法的特點(diǎn)(四)高效液相色譜分析方法的建立第二節(jié) 色譜法在發(fā)酵工程中的應(yīng)用(一)反相HPLC雙檢測器法同時測定發(fā)酵液中的有機(jī)酸與葡萄糖(二)AQC柱前衍生高效液相色譜法測定發(fā)酵液中21種氨基酸(三)利用反相高效液相色譜法測定發(fā)酵液中的生物素含量(四)利用乙腈作為內(nèi)標(biāo)氣相色譜法快速測定發(fā)酵液中的乳酸第六章 過程工程參數(shù)測定第一節(jié) 微生物反應(yīng)器的混合原理第二節(jié) 微生物反應(yīng)器的氧傳遞過程原理實驗七十一 亞硫酸鈉氧化法測定氧傳遞系數(shù)K1a實驗七十二 用溶氧電極法的動態(tài)法測定氧傳遞系數(shù)K1a實驗七十三 混合時間測定第二部分 綜合實驗第七章 微生物培養(yǎng)實驗一 聚賴氨酸生產(chǎn)菌株的選育與發(fā)酵工藝的研究實驗二 D－核糖發(fā)酵實驗三 重組大腸桿菌發(fā)酵人銅鋅超氧化物歧化酶的高密度、高表達(dá)實驗四 黑曲霉產(chǎn)纖維素酶液體發(fā)酵實驗五 擬干酪乳桿菌發(fā)酵生產(chǎn)乳酸實驗六 嘌呤核苷磷酸化酶在大腸桿菌中表達(dá)和酶學(xué)性質(zhì)測定實驗七 酶催化蔗糖轉(zhuǎn)化反應(yīng)實驗八 酵母培養(yǎng)中的基質(zhì)代謝、呼吸和生長的參數(shù)檢測與參數(shù)相關(guān)分析實驗九 酵母菌厭氧乙醇發(fā)酵實驗十 重組畢赤酵母高密度發(fā)酵表達(dá)植酸酶及其分離純化第八章 動物細(xì)胞培養(yǎng)實驗十一 造血細(xì)胞分離、集落培養(yǎng)及表型分析實驗十二 動物細(xì)胞的培養(yǎng)和計數(shù)實驗十三 細(xì)胞的冷凍和復(fù)蘇參考文獻(xiàn)

章節(jié)摘錄

　?、咴诎l(fā)酵工程實驗室中，培養(yǎng)基的制備是必不可少的操作，對不同的發(fā)酵實驗其培養(yǎng)基的制備過程有共同之處，在規(guī)模較大的實驗室中，專門沒立一個培養(yǎng)基制備的工作室可以避免與其他實驗工作相互干擾?！　、喟l(fā)酵的樣品等必須保存在較低的溫度下，因此發(fā)酵實驗室必須有足夠的冰箱容量（或冷房），來保存這些樣品。有時對于特殊的要求必須有冷凍的環(huán)境來保存樣品。　?、醿x器分析應(yīng)該有專門的分析室，室內(nèi)要保持潔凈和通風(fēng)條件，如有易燃?xì)怏w要放置在儀器室外的專門房間，以保證儀器的使用壽命和操作人員的安全?！　≡诎l(fā)酵工程實驗室設(shè)計時必須使各個房間及儀器等的布局合理，從而保證在整個實驗過程中用于物品傳輸?shù)人ㄙM(fèi)的時間最少。實驗室設(shè)計還需考慮為實驗室工作人員提供辦公室等，特別對于大規(guī)模學(xué)生實驗室也應(yīng)根據(jù)教學(xué)班的安排設(shè)置大實驗室?！　∪l(fā)酵工程實驗設(shè)計（方案）的基本步驟　　在研究微生物生長和代謝中由于微生物受環(huán)境條件的直接和巨大影響以及代謝活動的多樣性和調(diào)節(jié)控制的復(fù)雜性，經(jīng)常需要通過大量的實驗來探索一個生化過程的規(guī)律，確定最佳工藝配方或最佳發(fā)酵條件，使菌株的生產(chǎn)潛力得到最大限度的發(fā)揮?！　∪绾伟才艑嶒灒箤嶒灤螖?shù)盡量少，而又能達(dá)到好的實驗效果呢？這是科學(xué)研究者經(jīng)常碰到的問題。解決這個問題有一專門的方法，稱為“實驗設(shè)計”。所謂實驗設(shè)計，是指運(yùn)用數(shù)理統(tǒng)計的理論和方法來經(jīng)濟(jì)地合理地安排實驗方案和分析實驗結(jié)果。采用好的實驗設(shè)計方法，可以減少實驗次數(shù)，縮短實驗周期，降低實驗成本，事半功倍地迅速得到最佳的結(jié)果。　?。ㄒ唬嶒炘O(shè)計（方案）的內(nèi)容及要求（明道緒，2002）　　進(jìn)行任何一項科學(xué)實驗，在實驗前必須制定一個科學(xué)的、全面的實驗計劃，以便使該項研究工作能夠順利開展，從而保證實驗任務(wù)的完成。雖然科研項目的級別、種類等有所不同，但基本要求是一致的。

圖書封面

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