大豆在暗誘導(dǎo)下光周期及衰老相關(guān)基因的差異表達(dá)研究

內(nèi)容概要

黑龍江省是我國(guó)大豆主要生產(chǎn)基地，加入世貿(mào)組織后，大豆面臨嚴(yán)重的進(jìn)口壓力。主要原因是我國(guó)大豆單產(chǎn)低，競(jìng)爭(zhēng)力不強(qiáng)。大豆屬于短日照植物，其生長(zhǎng)發(fā)育對(duì)光周期反應(yīng)非常敏感，這一特性嚴(yán)重阻礙大豆品種的適應(yīng)性，是制約大豆單產(chǎn)提高和穩(wěn)產(chǎn)的關(guān)鍵因素。暗處理相當(dāng)于短日照，可以縮短大豆的開花和成熟期，其表型之一是加速葉片的衰老。葉細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、代謝和基因表達(dá)都協(xié)調(diào)的發(fā)生變化，細(xì)胞器官的組分被依次有序的分解。代謝變化包括合成代謝活性的減弱，如光合作用和蛋白質(zhì)的合成，以及分解代謝的加速，如核酸降解和蛋白水解。這些對(duì)維持植物生長(zhǎng)和生殖是非常必要的，基因轉(zhuǎn)錄物豐度的巨大變化揭示了從有光合活性的葉片到作為流動(dòng)營(yíng)養(yǎng)物來源的衰老器官來維持發(fā)育的轉(zhuǎn)變情況。    為了打破大豆種植區(qū)域的局限性，本研究在細(xì)胞分子水平上從基因差異表達(dá)的角度研究短日照光周期誘導(dǎo)開花和衰老過程中基因轉(zhuǎn)錄豐度的變化，克隆與大豆光周期反應(yīng)及衰老有關(guān)的基因，從而探索大豆葉片感受日長(zhǎng)變化誘導(dǎo)開花和衰老的復(fù)雜機(jī)制。雖然植物花器官的分化發(fā)生在頂端分生組織，在開花過程中的基因表達(dá)也必然在頂端分生組織中有所反映，然而植物感受光的器官是葉片，并利用長(zhǎng)距離信號(hào)通過韌皮部傳導(dǎo)至頂端分生組織(SAM)影響生殖生長(zhǎng)，在光周期控制開花過程中也必然牽涉葉片中很多基因的互作。由于黑暗的長(zhǎng)度是開花時(shí)間的關(guān)鍵決定因素，在光周期控制開花過程中基因可能在夜間表達(dá)有差異，所以，以晝夜交替時(shí)的大豆的兩個(gè)樣本的葉片為研究目的對(duì)象，構(gòu)建了差異表達(dá)的cDNA消減文庫，發(fā)現(xiàn)與暗誘導(dǎo)相關(guān)的差異表達(dá)基因，揭示了有關(guān)參與機(jī)體暗適應(yīng)下蛋白質(zhì)的上調(diào)表達(dá)的信息，為進(jìn)一步分離暗處理產(chǎn)生差異表達(dá)基因奠定了基礎(chǔ)。    通過轉(zhuǎn)化短日照煙草，進(jìn)行光周期反應(yīng)基因的功能驗(yàn)證，分析該類基因在光周期反應(yīng)中的作用。同時(shí)，研究外源激素的施加對(duì)光周期途徑相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因表達(dá)的影響；分析開花誘導(dǎo)中基因組織特性的表達(dá)情況。本研究的宗旨是通過基因的克隆和改造，試圖從根本上改變大豆對(duì)光的敏感性，為大豆高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)提高尋找新的突破口，從根本上扭轉(zhuǎn)我國(guó)大豆依賴于進(jìn)口的被動(dòng)局面。    主要結(jié)果如下。    1.本試驗(yàn)首次應(yīng)用抑制性消減雜交(SSH)技術(shù)以東農(nóng)u3大豆的短日照(8h光/16h暗)和長(zhǎng)日照(16h光/8h暗)兩個(gè)樣本為研究目的對(duì)象，構(gòu)建了含有1738個(gè)克隆的差異表達(dá)的cI)NA消減文庫，對(duì)148個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序，在此基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)了76個(gè)與暗誘導(dǎo)相關(guān)的差異表達(dá)ESTs(上調(diào)至少3倍)，根據(jù)Blastn和Blastx推測(cè)這些ESTs的功能包括參與轉(zhuǎn)錄、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)類蛋白；參與大分子降解的酶類如蛋白和核酸的降解、參與細(xì)胞壁修飾的合成代謝、初級(jí)代謝以及次級(jí)代謝的酶類和解毒與防衛(wèi)的壓力反應(yīng)的基因。揭示了有關(guān)參與機(jī)體暗適應(yīng)下蛋白質(zhì)的上調(diào)表達(dá)的信息，為進(jìn)一步分離短日處理產(chǎn)生差異表達(dá)基因奠定了基礎(chǔ)。    2.為了研究GmRAV在大豆短日照信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的可能作用，我們利用cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)技術(shù)從大豆中克隆了編碼GmRAv的cDNA序列。序列分析結(jié)果表明，GmRAV基因編碼351個(gè)氨基酸，含有AP2/ERF和B3結(jié)構(gòu)域，GenBank登陸號(hào)為DQ147914，其DNA序列與辣椒、水稻和擬南芥RAV基因高度同源。    3.Real-time RT-PCR分析在短日照和長(zhǎng)日照條件下大豆葉片中GmRAV基因mRNA轉(zhuǎn)錄物的豐度變化，表明該基因的豐度在短日照(SD)時(shí)都要顯著高于在長(zhǎng)日照(LD)條件下的豐度。    4.分析GmRAV基因在不同組織中mRNA轉(zhuǎn)錄物的豐度變化表明，SD強(qiáng)烈誘導(dǎo)GmRAV基因在葉、根和莖中的表達(dá)。    5.構(gòu)建了植物表達(dá)載體pBI121-GmRAV，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草過量表達(dá)該基因，獲得卡那霉素抗性植株54株。PCR方法鑒定Tn轉(zhuǎn)基因株系，獲得18個(gè)轉(zhuǎn)基因的PCR陽性植株。通過Northern分析表明這4株轉(zhuǎn)基因煙草中的GmRAV基因都轉(zhuǎn)錄，表明它們都已成功轉(zhuǎn)入煙草中，并正常表達(dá)。     6.GmRAV過量表達(dá)的煙草植株與對(duì)照相比無論在長(zhǎng)日照和短日照下植株都明顯矮小，節(jié)間距短，節(jié)數(shù)少，并且在土壤中生長(zhǎng)時(shí)葉片更深綠，葉片小，GmRAV過量表達(dá)對(duì)莖和葉的發(fā)育以及植株的生長(zhǎng)有推遲抑制作用。轉(zhuǎn)大豆GmRAV基因的煙草植株無論在長(zhǎng)日照和短日照條件下均表現(xiàn)出開花延遲的特征，并且光周期敏感性增強(qiáng)，非轉(zhuǎn)基因煙草在長(zhǎng)日照比短日照條件下開花提前3天，而GmRAV過表達(dá)的煙草植株在長(zhǎng)日照比短日照條件下開花卻提前13天。     7.GmRAV是BR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的抑制因子，GmRAV基因通過抑制BR信號(hào)而抑制植物細(xì)胞伸長(zhǎng)從而抑制生長(zhǎng)，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植株矮化。     8.GmRAV是GA生長(zhǎng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的促進(jìn)因子，是ABA和黑暗促進(jìn)衰老途徑中的促進(jìn)因子。

作者簡(jiǎn)介

趙琳(1980-  )，女，黑龍江省鶴崗市人，博士，助理研究員。主要從事大豆生物技術(shù)研究，2007年至今工作于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/大豆生物學(xué)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。在利用抑制性消減雜交技術(shù)尋找差異表達(dá)基因、基因克隆、生物信息學(xué)、植物組織培養(yǎng)、轉(zhuǎn)基因及轉(zhuǎn)基因品種培育研究方面取得一定的成績(jī)。

書籍目錄

1  引言  1.1  植物開花機(jī)理的研究進(jìn)展    1.1.1  植物花芽分化過程的調(diào)節(jié)機(jī)制    1.1.2  環(huán)境條件對(duì)植物成花的調(diào)控  1.2  大豆光周期現(xiàn)象的研究進(jìn)展    1.2.1  大豆生育期性狀的光周期反應(yīng)特性    1.2.2  光周期對(duì)大豆農(nóng)藝性狀和籽粒品質(zhì)的影響    1.2.3  大豆中光敏感性E等位基因的研究進(jìn)展    1.2.4  大豆開花時(shí)間基因圖譜的繪制  1.3  擬南芥開花誘導(dǎo)的分子生物學(xué)研究進(jìn)展    1.3.1  光周期途徑    1.3.2  春化促進(jìn)途徑    1.3.3  自主途徑    1.3.4  赤霉素途徑    1.3.5  染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和開花抑制    1.3.6  擬南芥開花途徑的整合    1.3.7  植物中的擬南芥開花途徑的基因保守性  1.4  植物衰老的研究    1.4.1  衰老的生理生化反應(yīng)特性    1.4.2  衰老學(xué)說    1.4.3  衰老的調(diào)控  1.5  RAV轉(zhuǎn)錄因子的研究進(jìn)展  1.6  基因差異表達(dá)的研究方法    1.6.1  基于cDNA的PCR擴(kuò)增方法    1.6.2  基于差減雜交的克隆方法    1.6.3  表達(dá)序列標(biāo)簽    1.6.4  基因表達(dá)系列分析    1.6.5  微陣列雜交    1.6.6  實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)  1.7  植物遺傳轉(zhuǎn)化    1.7.1  植物遺傳轉(zhuǎn)化方法  1.8  研究目的和意義2  材料和方法  2.1  實(shí)驗(yàn)材料和試劑    2.1.1  植物材料    2.1.2  菌種及載體    2.1.3  主要試劑  2.2實(shí)驗(yàn)方法    2.2.1  抑制性消減雜交(SSH)    2.2.2  抑制消減文庫的構(gòu)建    2.2.3  反向Northem blot斑點(diǎn)雜交篩選消減文庫    2.2.4  測(cè)序及序列同源性檢索    2.2.5  實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)一步驗(yàn)證差異表達(dá)的片段    2.2.6  RACE方法克隆大豆GmRAV基因    2.2.7  Real-time RT-PCR分析GmRAV的表達(dá)    2.2.8  植物表達(dá)載體pBI121-GmRAV的構(gòu)建    2.2.9  農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草葉盤    2.2.10  轉(zhuǎn)基因煙草的分子生物學(xué)檢測(cè)    2.2.11  轉(zhuǎn)GmRAV基因煙草T2代功能分析3  結(jié)果與分析  3.1  抑制性消減雜交(SSH)    3.1.1  大豆總RNA的提取    3.1.2  SMART技術(shù)合成cDNA    3.1.3  雙鏈cDNA的Rsal酶切結(jié)果    3.1.4  正向差減產(chǎn)物的PCR擴(kuò)增結(jié)果    3.1.5  反向Northern斑點(diǎn)雜交篩選結(jié)果    3.1.6  測(cè)序與同源性檢索結(jié)果    3.1.7  候選cDNA片段差異表達(dá)檢測(cè)分析結(jié)果    3.1.8  基因功能相關(guān)分析  3.2  大豆GmRAV基因克隆    3.2.1  大豆GmRAV基因5'RACE和3'RACE克隆    3.2.2  大豆GmRAV基因全長(zhǎng)序列的生物信息學(xué)及系統(tǒng)進(jìn)化分析    3.2.3  GmRAV全長(zhǎng)基因組DNA序列的獲得  3.3  大豆GmRAV基因表達(dá)研究    3.3.1  大豆葉片中GmRAV基因在LD和SD條件下基因表達(dá)    3.3.2  大豆GmRAV基因在LD和SD條件下組織特異性表達(dá)分析    3.3.3  激素對(duì)大豆葉片中GmRAV基因的表達(dá)影響  3.4  植物表達(dá)載體pBI121-GmRAV的構(gòu)建  3.5  煙草的遺傳轉(zhuǎn)化    3.5.1  叢生芽和根的誘導(dǎo)    3.5.2  轉(zhuǎn)基因煙草的PCR檢測(cè)    3.5.3  轉(zhuǎn)基因煙草的PCR-Southem檢測(cè)    3.5.4  轉(zhuǎn)基因煙草的Nortthem blot檢測(cè)    3.5.5  長(zhǎng)日照和短日照下轉(zhuǎn)基因煙草的T2代表型觀察    3.5.6  轉(zhuǎn)GmRAV基因煙草植株矮化與BR和GA激素有關(guān)    3.5.7  過量表達(dá)GmRAV增強(qiáng)了ABA促進(jìn)葉片衰老的效應(yīng)    3.5.8  暗處理下GmRAV過量表達(dá)加速植株的衰老4  討論  4.1  光周期和衰老相關(guān)基因表達(dá)譜分析  4.2  光周期和衰老相關(guān)基因的克隆  4.3  植物表達(dá)載體的構(gòu)建及煙草的遺傳轉(zhuǎn)化    4.3.1  采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物的優(yōu)勢(shì)    4.3.2  轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌及其鑒定    4.3.3  用于轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌的培養(yǎng)    4.3.4  葉盤法轉(zhuǎn)化煙草5  結(jié)論參考文獻(xiàn)附錄攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文圖版

章節(jié)摘錄

　　1引言　　1.1植物開花機(jī)理的研究進(jìn)展　　植物的花發(fā)育分為開花誘導(dǎo)、花的發(fā)端和花器官發(fā)育三個(gè)階段。開花是植物在生命周期過程中從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖發(fā)育所進(jìn)行的重要轉(zhuǎn)變，是植物有性生殖的重要一步，所以，植物必須精確地控制開花，才能確保在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間進(jìn)行有性生殖和種子成熟。生殖生長(zhǎng)是高等植物生活史中的重要階段，而作為執(zhí)行生殖過程的重要器官——花器官的形成和發(fā)育即成花機(jī)理更是一直受到生物學(xué)家和農(nóng)學(xué)家的關(guān)注?！　≈参镌跔I(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的基礎(chǔ)上、在一定的外界條件誘導(dǎo)下，莖尖分生組織從分化枝葉轉(zhuǎn)為分化生殖器官（花芽），花芽的分化是植物由營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)轉(zhuǎn)入生殖生長(zhǎng)的重要標(biāo)志。大多數(shù)高等植物在其生活周期中均存在一個(gè)共同的特點(diǎn)，就是在開花之前要達(dá)到一定的年齡或處于一定的生理狀態(tài)，然后才能具有接受外界環(huán)境誘導(dǎo)而開花的能力。植物在感受外界刺激而開花之前必須達(dá)到的生理狀態(tài)稱為花熟狀態(tài)。植物在達(dá)到花熟狀態(tài)之前的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段稱為幼年期（juvenilephase）。處于幼年期的植物即使?jié)M足了其開花所需的外界條件也不能開花。已經(jīng)達(dá)到花熟狀態(tài)的植物，也只有在適宜的外界條件下才能開花。也就是說當(dāng)植物已達(dá)花熟狀態(tài)時(shí)，外界環(huán)境的某些因素對(duì)植物的開花起主導(dǎo)作用。植物總是在合適的季節(jié)才能開花，而季節(jié)的變化主要與溫度和日照長(zhǎng)度的變化有關(guān)。研究證明，植物的開花與溫度高低和日照長(zhǎng)短有密切的關(guān)系?！　?hellip;…

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