基因克隆與操作

前言

　　自本書第一版出版以來(lái)，基因克隆和操作的領(lǐng)域已發(fā)生了很大的變化，我在第二版中進(jìn)行的修訂反映了這種進(jìn)展。PCR方法的應(yīng)用已得到了極大的發(fā)展，在許多生物中都可以用到“組學(xué)”和反向遺傳學(xué)的技術(shù)，一些成熟的領(lǐng)域也取得了很大的進(jìn)步，如用于表達(dá)蛋白質(zhì)的宿主和載體，以及使用熒光蛋白作為報(bào)告基因。像在第一版中那樣，我已盡量強(qiáng)調(diào)有關(guān)我們所用載體的基本原理，并盡量避免使用長(zhǎng)長(zhǎng)的、詳細(xì)的列表（從任何角度來(lái)看，這些列表都很快就會(huì)過時(shí)）。由于認(rèn)識(shí)到了設(shè)計(jì)針對(duì)各種實(shí)驗(yàn)狀態(tài)的適當(dāng)策略的必要性，我增加了最后一章，給出了一些實(shí)例和建議。感謝我實(shí)驗(yàn)室的成員，當(dāng)為了完成此版本（我的眾所周知的“興趣巨著”）而不得不推遲其他工作時(shí)，他們耐心地等待。我要特別感謝那些以各種方式給予直接幫助的人，特別是Mim Bower、Jon Burton、Ellen Nisbet、Saul。Purton、Beatrix Schlarb-Ridley和Petrusde Vries。我也要感謝劍橋大學(xué)出版社的KatrinaI-Ialliday和Clare Georgy，以及Keyword集團(tuán)的Peter Lewis和Rasika Mathur，感謝他們的技術(shù)專長(zhǎng)、耐心和鼓勵(lì)。

內(nèi)容概要

本書作者克里斯托弗·豪是劍橋大學(xué)植物與微生物生物化學(xué)專業(yè)的教授，教授分子生物學(xué)達(dá)20年。本書是對(duì)第一版的完全更新，反映了基因克隆和操作領(lǐng)域最新的進(jìn)展，對(duì)重組DNA技術(shù)進(jìn)行了全面而簡(jiǎn)潔的介紹：首先闡釋了生物化學(xué)的基本原理；然后介紹了PCR以及使用大腸桿菌宿主和質(zhì)粒、噬菌體和雜合載體進(jìn)行克??；之后介紹了文庫(kù)的構(gòu)建和篩選，以及如何對(duì)克隆化序列進(jìn)行改造、滅活和表達(dá)；最后討論了在許多其他生物中進(jìn)行的遺傳操作，包括細(xì)菌、真菌、藻類，以及植物、昆蟲和哺乳動(dòng)物。本書是為要使用重組DNA技術(shù)的高年級(jí)本科生、研究生和科研工作者而作，重點(diǎn)放在特定類型克隆載體上，以幫助讀者理解并能夠在新的實(shí)驗(yàn)狀態(tài)下提出適當(dāng)?shù)牟呗?。本書還介紹了一系列“現(xiàn)實(shí)的”生物學(xué)問題，以使讀者能夠評(píng)估自己對(duì)知識(shí)的理解并準(zhǔn)備考試。

書籍目錄

譯者序第二版前言第一版前言第1章　工具　1.1　前言　1.2　切割　1.3　修飾　1.4　連接　1.5　轉(zhuǎn)化　1.6　從大腸桿菌中純化質(zhì)粒DNA　1.7　核酸的凝膠電泳　1.8　寡核苷酸合成　1.9　微陣列第2章　聚合酶鏈反應(yīng)　2.1　基本技術(shù)　2.2　預(yù)防措施和缺點(diǎn)　2.3　改良第3章　簡(jiǎn)單克隆　3.1　基本實(shí)驗(yàn)　3.2　載體、轉(zhuǎn)化和宿主　3.3　修飾　3.4　接頭、銜接子和序列盒第4章　用于大腸桿菌的其他載體系統(tǒng)　4.1　前言　4.2　BAC載體　4.3　M13噬菌體載體　4.4　入噬菌體　4.5　黏?！?.6　Mu噬菌體　4.7　P1噬菌體第5章　文庫(kù)構(gòu)建　5.1　前言　5.2　基因組文庫(kù)　5.3　cDNA文庫(kù)　5.4　專業(yè)文庫(kù)第6章　文庫(kù)篩選　6.1　前言　6.2　數(shù)據(jù)庫(kù)篩選　6.3　編碼功能的實(shí)驗(yàn)篩選　6.4　其他功能的篩選：報(bào)告基因第7章　改造與誘變　7.1　前言　7.2　基于限制性內(nèi)切核酸酶的方法　7.3　寡核苷酸定向誘變　7.4　選擇正確的突變　7.5　滅活基因第8章　克隆化DNA的應(yīng)用　8.1　作為DNA使用　8.2　RNA的合成　8.3　蛋白質(zhì)的合成　8.4　體外翻譯　8.5　體內(nèi)表達(dá)　8.6　研究基因功能：報(bào)告基因和標(biāo)簽第9章　使用其他生物　9.1　前言　9.2　細(xì)菌　9.3　釀酒酵母　9.4　其他真菌　9.5　藻類　9.6　維管植物　9.7　細(xì)胞器轉(zhuǎn)化　9.8　秀麗隱桿線蟲　9.9　昆蟲　9.10　哺乳動(dòng)物第10章　實(shí)例　10.1　前言參考文獻(xiàn)索引

章節(jié)摘錄

　　從凝膠中回收材料（通常是DNA）通常很有用，當(dāng)要從一種消化物中克隆一個(gè)特定的限制酶切片段時(shí)，需要使用凝膠將目標(biāo)片段與其他DNA分開，然后從凝膠中回收用于克隆的片段。回收方法有以下幾種，目前第一種方法是最常用的。1.溶解或消化凝膠。如果凝膠是用低熔點(diǎn)瓊脂糖制成的，那么我們只需要切下含有目標(biāo)DNA的膠條，通過加熱熔化凝膠介質(zhì)即可。用促溶劑處理或用瓊脂水解酶消化能夠溶解熔點(diǎn)較高的凝膠。一旦凝膠被溶解，就可以通過適當(dāng)?shù)娜軇┨崛』蚴褂霉枋兓瘉?lái)回收DNA。2.擴(kuò)散。從凝膠上切下含有待回收DNA的膠條，將其碾碎，在緩沖液中浸泡幾個(gè)小時(shí)，則大多數(shù)的DNA從凝膠中擴(kuò)散出來(lái)，然后用過濾或離心的方法除去凝膠。3.冷凍一擠壓（freeze_squeeze）。從凝膠上切下含有DNA的膠條，在液氮中冷凍，這樣可以破壞凝膠的結(jié)構(gòu)，然后離心通過玻璃棉填料，填料阻止凝膠通過，但能夠使液體（含有溶解的DNA）通過。4.電洗脫。有幾種涉及電洗脫的技術(shù)，這里列舉三種。a.從凝膠上切下膠條，密封到含有緩沖液的透析袋中，繼續(xù)進(jìn)行電泳，DNA離開凝膠，但被截留在透析袋內(nèi)的緩沖液中。b.在緊挨著目標(biāo)DNA下方的凝膠上切一個(gè)槽，充入緩沖液，繼續(xù)電泳，DNA從凝膠中出來(lái)，進(jìn)入含有緩沖液的槽中，可以用移液器從槽內(nèi)取出DNA。c.將一片適當(dāng)?shù)哪げ迦刖o挨著DNA的凝膠中，繼續(xù)電泳，DNA粘到膜上，取出膜，用適當(dāng)?shù)娜芤合聪翫NA。DEAE纖維素膜就是一種合適的膜，用高鹽緩沖液洗滌可以從該膜上洗下DNA。　　……

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