蛋白質(zhì)純化實驗方案與應用

前言

　　在當前日益廣泛的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能研究中，尤其是在從生物材料中進行多種蛋白的分離、純化和鑒定的研究中，蛋白質(zhì)樣品的分析和制備技術(shù)的應用日益廣泛。特別是當前分子生物學和現(xiàn)代醫(yī)學的發(fā)展對不同生物組織中蛋白的研究日益增多，了解和掌握此類蛋白分析、分離的現(xiàn)代化方法，對于研究者來說顯得尤為重要。　　生命科學是實驗性很強的科學，所以生命科學的發(fā)展對實驗技術(shù)提出了更高要求。為了有助于生命科學工作者進一步了解蛋白純化相關(guān)實驗，更好地設計實驗方案，更有效地開展實驗過程，更合理地處理實驗結(jié)果，我們編寫了《蛋白質(zhì)純化實驗方案與應用》。　　《蛋白質(zhì)純化實驗方案與應用》詳細介紹了材料的預處理、蛋白質(zhì)的粗提、經(jīng)典色譜分離、高效液相色譜、質(zhì)譜、電色譜、分子印跡、電泳以及蛋白質(zhì)檢測的基本原理及實驗設計方案?！兜鞍踪|(zhì)純化實驗方案與應用》強調(diào)可操作性，對每一項實驗技術(shù)都系統(tǒng)介紹其原理方法和實驗過程，讓讀者了解到每一點成就都是建立在大量方案設計、具體步驟以及實驗結(jié)果的正確處理的基礎(chǔ)之上的。其中不僅含有經(jīng)典的實驗技術(shù)，還特別突出了當前實驗的新理論、新技術(shù)與新發(fā)展，給蛋白質(zhì)純化專業(yè)人員以借鑒和引導作用。　　《蛋白質(zhì)純化實驗方案與應用》的完成離不開南開大學生命科學學院相關(guān)實驗室的老師和同學們的大力支持，同時GE公司提供的案例對編者啟發(fā)很大，在此一并表示感謝?！　∮捎谒剿?，《蛋白質(zhì)純化實驗方案與應用》中涉及的某些特殊領(lǐng)域，編者未能面面俱到，同時書中錯漏之處在所難免，敬請廣大讀者批評指正。

內(nèi)容概要

本書詳細介紹了各類蛋白質(zhì)純化實驗技術(shù)，包括材料的預處理、蛋白質(zhì)的粗提、經(jīng)典色譜方法、高效液相色譜、質(zhì)譜、電色譜、分子印跡、電泳以及蛋白質(zhì)檢測的實驗方案及應用實例。    強調(diào)可操作性，對每一項實驗技術(shù)，都系統(tǒng)介紹其原理方法和實驗過程，特別注重講解問題分析及解決方案，讓讀者了解到每一點成就都是建立在大量方案設計、具體步驟以及實驗結(jié)果的正確處理的基礎(chǔ)之上。    不僅含有經(jīng)典的實驗技術(shù)，還特別突出了當前實驗的新理論、新技術(shù)與新發(fā)展，給予蛋白質(zhì)純化專業(yè)人員以借鑒和引導作用。    本書對于遺傳學、細胞生物學、分子生物學，以及醫(yī)學和生物工程領(lǐng)域研究人員開展蛋白質(zhì)相關(guān)研究，具有很強的參考價值。

書籍目錄

第1章  緒論  1.1  蛋白質(zhì)的研究歷史  1.2  蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)和生物學特性  1.3  蛋白質(zhì)純化手段的歷史回顧  1.4  純化蛋白的應用  參考文獻第1部分  材料的預處理和蛋白質(zhì)的粗提 第2章  不同來源材料的預處理  2.1  不同材料的預處理    2.1.1  植物材料的預處理    2.1.2  動物材料的預處理    2.1.3  微生物材料的預處理  2.2  細胞的破碎    2.2.1  機械法    2.2.2  非機械法  方案2.1  超聲波法提取煙草葉中的3-磷酸甘油脫氫酶  方案2.2  從豬胰臟中提取胰凝乳蛋白酶  方案2.3  從大腸桿菌中提取誘導表達的（His）6-X  參考文獻第3章  蛋白質(zhì)的沉淀  3.1  鹽析法  3.2  有機溶劑沉淀法  3.3  等電點沉淀法  3.4  非離子多聚物沉淀法  3.5  選擇性沉淀法  方案3.1  用鹽析法選擇性沉淀蛋白質(zhì)  方案3.2  用有機溶劑沉淀蛋白質(zhì)  方案3.3  使用蛋白質(zhì)排阻和擁擠劑選擇性沉淀蛋白質(zhì)  參考文獻第4章  蛋白質(zhì)的濃縮  4.1  吸附法  4.2  超濾法  4.3  沉淀法  4.4  透析法  4.5  冷凍干燥法  4.6  雙水相分離法  方案4.1用透析袋進行脫鹽、濃縮和更換緩沖液  方案4.2用不對稱圓盤膜超濾進行濃縮或透析  參考文獻第2部分  色譜法分離純化蛋白質(zhì)   參考文獻第5章  凝膠過濾色譜    5.1  基本原理    5.2  實驗方案設計    5.2.1  凝膠介質(zhì)的選擇    5.2.2  凝膠介質(zhì)的預處理    5.2.3  色譜柱的選擇    5.2.4  凝膠柱的裝填    5.2.5  樣品處理和上樣    5.2.6  洗脫和收集    5.2.7  色譜柱的清洗、再生與保存  方案5.1  用凝膠過濾色譜更換緩沖液  方案5.2  凝膠過濾色譜分離三種分子量不同的蛋白質(zhì)    參考文獻第6章  離子交換色譜  6.1  基本原理  6.2  實驗方案設計    6.2.1  離子交換介質(zhì)的選擇    6.2.2  流動相的選擇    6.2.3  色譜柱的選擇    6.2.4  離子交換劑預處理和裝柱    6.2.5  加樣    6.2.6  洗脫    6.2.7  洗脫組分的收集和分析    6.2.8  離子交換劑的再生、清洗與儲存  方案6.1  弱陰離子交換色譜和強陽離子交換色譜在分離純化單克隆抗體中的應用  參考文獻第7章  親和色譜第8章  疏水色譜第9章  分子印跡技術(shù)第10章  高效液相色譜法分離純化蛋白質(zhì)第11章  毛細管電色譜及其在蛋白質(zhì)分離純化中的應用第12章  其他色譜分析方法簡介第3部分  電泳法分離純化蛋白質(zhì) 第13章  聚丙烯酰胺凝膠電泳第14章  聚丙烯酰胺等電聚焦第15章  雙向電泳第4部分  蛋白質(zhì)純化效果的評價和蛋白質(zhì)分析 第16章  蛋白質(zhì)濃度、純度及活性的分析第17章  蛋白質(zhì)的分析及應用

章節(jié)摘錄

　　固定相（色譜顆粒，通常填充在圓柱中），流動相（通常是緩沖液）。除凝膠過濾色譜外，所有應用于蛋白質(zhì)純化的柱色譜都具有吸附性質(zhì)。在通常情況下分離蛋白質(zhì)混合物時，進樣后柱色譜條件能夠選擇性保留目的蛋白。在理想狀態(tài)下，此目的蛋白為唯一保留在色譜柱上的組分，但事實上很難實現(xiàn)。上樣完成后，色譜柱用流動相沖洗（灌洗）以除去不被色譜柱保留的組分。改變流動相的組成，將色譜柱吸附的組分洗脫下來，洗脫液收集于試管中，用于進一步的總蛋白測定和目的蛋白檢測，收集含有目的蛋白的部分用于下一步的純化，這就是用色譜法分離純化蛋白質(zhì)的基本步驟。　　任何純化過程的初始步驟均可以設計成為：①分離和濃縮目的蛋白；②去除大部分雜質(zhì)，包括顆粒物、脂質(zhì)和可能污染或堵塞色譜柱的其他物質(zhì)。初始化步驟不是著重于目的蛋白的純化程度，而在于對目標蛋白有很高的回收率。在經(jīng)過了粗分離之后，蛋白純化就進入下一階段，稱為中間純化期。在這個階段，樣品中應當僅存留少量的其他類型的生物分子（如脂質(zhì)和核酸）。目的蛋白和殘留的雜蛋白質(zhì)可能具有相同的結(jié)構(gòu)和功能的屬性，其性質(zhì)取決于粗分離所用的分離技術(shù)。所以在中間純化期最好選擇與粗分離期所選擇的不同屬性對目的蛋白和雜質(zhì)蛋白進行分離。聯(lián)合使用離子交換色譜和疏水相互作用色譜或者聯(lián)合使用陽離子交換和陰離子交換都是非常有效的蛋白質(zhì)分離純化策略。在中間純化期所用的色譜技術(shù)應該根據(jù)單一理化性質(zhì)的細小差異將目的蛋白和雜蛋白分開，首要目標是高分辨率和高回收率，要實現(xiàn)這些目標，應該選用直徑更小的色譜介質(zhì)，較小的凝膠顆粒介質(zhì)的優(yōu)點是能減小峰寬，從而提高分辨率?！　∶恳粋€蛋白質(zhì)具有一系列別于其他蛋白質(zhì)分子的特定屬性，這些屬性包括大小、形狀、總電荷、表面疏水基團百分率、與特定配基結(jié)合的能力等等。單就任何一項屬性作比較，有相當多的蛋白質(zhì)分子與其他蛋白質(zhì)分子在性質(zhì)上相近。但是，所有蛋白質(zhì)都具備獨特的上述屬性的特定組合，構(gòu)成了這個蛋白質(zhì)特有的色譜“指紋”。色譜技術(shù)可以根據(jù)蛋白質(zhì)這些屬性上的差異將不同的蛋白質(zhì)進行分離，采用任何一個利用蛋白質(zhì)分子性質(zhì)差異的色譜技術(shù)將大大提高目標蛋白的純度，組合使用這些色譜技術(shù)可以制備高純度的蛋白質(zhì)。用于蛋白質(zhì)分離純化的色譜方法主要有凝膠過濾色譜、離子交換色譜、親和色譜、疏水色譜。每種色譜方法都有自己的特點：①凝膠過濾色譜，根據(jù)蛋白質(zhì)分子量或分子形狀的差異達到分離的目的，效率不高，對低濃度的樣品沒有富集作用，上樣量小；②離子交換色譜，根據(jù)蛋白質(zhì)在特定pH條件下表面電荷的差異進行分離，樣品必須沒有高濃度的鹽；③疏水色譜，根據(jù)蛋白質(zhì)表面疏水性的差異分離蛋白質(zhì)，分離效率高，上樣量大，特別適合分離鹽析沉淀的樣品；④親和色譜，基于蛋白質(zhì)和特定配基之間的特異結(jié)合作用進行分離，是最有效的手段，關(guān)鍵是了解目標蛋白的特性以便選擇合適的色譜填料。

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