基因工程原理與實驗指導(dǎo)

前言

　　本書是在總結(jié)前人的基因工程教材基礎(chǔ)上編寫的。正如牛頓所說：“之所以我們能夠看得遠一點，是因為我們站在巨人的肩上。”我們能夠編寫出這本書，與前輩科學(xué)家在基因工程教學(xué)和科研中所做的貢獻密不可分。根據(jù)本科生學(xué)習(xí)時間少，學(xué)時縮短的現(xiàn)狀，同時融合了我們長期教學(xué)和科研經(jīng)驗，編寫了這本書。本書可以作為本科生的教材，用于生物技術(shù)、生物科學(xué)、生物工程專業(yè)學(xué)習(xí)，也可以作為研究生學(xué)習(xí)中的指導(dǎo)用書?！　”緯奶攸c是：①適應(yīng)理論學(xué)時縮短的需要，將內(nèi)容減少。現(xiàn)在的大學(xué)生基本上在第四學(xué)年進入實習(xí)，理論學(xué)習(xí)安排在前三個學(xué)年，所以理論學(xué)時減少，而目前所用教材內(nèi)容太多，學(xué)生沒時間學(xué)習(xí)。②將基因工程原理和實驗內(nèi)容有機結(jié)合在一起。多數(shù)教材將大部分精力集中在理論知識的講述方面，而基因工程是一門實驗性學(xué)科，沒有實驗導(dǎo)致學(xué)生學(xué)習(xí)知識不全面。③加入最新的知識內(nèi)容，適應(yīng)進一步學(xué)習(xí)和工作的需要。本書結(jié)合最新研究成果和方法，添加很多新的知識和內(nèi)容，為大學(xué)生進入研究生學(xué)習(xí)奠定基礎(chǔ)。④在很多地方加入圖示以便學(xué)生理解，也便于學(xué)生自學(xué)。同時，在教學(xué)和科研過程中，學(xué)生常常問到我們有哪些經(jīng)驗和教訓(xùn)，以避免在學(xué)習(xí)和科研中走彎路，在編寫過程中加入這部分內(nèi)容，增加了同學(xué)們學(xué)習(xí)時的真實感。　　本教材由劉亮偉、陳紅歌擔(dān)任主編，王明道為副主編，劉新育、高玉千參編。全書分兩部分：第一部分是基因工程原理；第二部分為基因工程實驗指導(dǎo)。第一部分分為八章，劉亮偉編寫了第一章、第五章、第六章、第二章部分內(nèi)容和第四章部分內(nèi)容；陳紅歌編寫了第三章、第七章；劉新育編寫了第二章部分內(nèi)容；高玉千編寫了第四章部分內(nèi)容；王明道編寫了第八章。第二部分由劉亮偉編寫。最后劉亮偉、陳紅歌對全書進行了統(tǒng)稿。特此感謝為科學(xué)做出貢獻的學(xué)者，感謝河南農(nóng)業(yè)大學(xué)對《基因工程》精品課程的認定，同時感謝編委老師的辛勤努力。

內(nèi)容概要

本書是在總結(jié)前人的基因工程教材基礎(chǔ)上編寫而成的。全書共分兩部分十二章，內(nèi)容包括基因工程原理和基因工程實驗指導(dǎo)。     本書可以作為本科生的教材，用于生物技術(shù)、生物科學(xué)、生物工程專業(yè)學(xué)習(xí)，也可以作為研究生學(xué)習(xí)中的指導(dǎo)用書。

書籍目錄

第一部分  基因工程原理  第一章  緒論    第一節(jié)  引言      一、基因工程定義      二、基因工程發(fā)展史    第二節(jié)  基因工程的研究內(nèi)容      一、技術(shù)路線      二、研究內(nèi)容    第三節(jié)  基因工程的應(yīng)用      一、基因工程藥物      二、轉(zhuǎn)基因動物      三、轉(zhuǎn)基因植物      四、其他方面的應(yīng)用    第四節(jié)  基因工程的安全性問題    本章問題  第二章  DNA重組工具酶    第一節(jié)  限制性內(nèi)切酶      一、限制性酶的類型和命名      二、限制性酶的特性      三、酶切末端的類型      四、限制性酶的切割方式      五、影響限制性酶活力的因素      六、限制性酶的酶切反應(yīng)體系      七、限制性酶的特殊類型    第二節(jié)  基因工程操作其他工具酶      一、連接酶      二、末端轉(zhuǎn)移酶      三、堿性磷酸酶      四、多聚核苷酸激酶T4 PNK      五、T7 DNA聚合酶      六、逆轉(zhuǎn)錄酶    本章問題  第三章  基因工程的載體    第一節(jié)  質(zhì)粒的一般特性      一、質(zhì)粒的生物學(xué)特性      二、質(zhì)粒DNA的構(gòu)型      三、質(zhì)粒DNA的提取    第二節(jié)  常用的質(zhì)?？寺≥d體      一、pBR322質(zhì)粒      二、pUC18／19質(zhì)粒      三、TA克隆載體    第三節(jié)  常用的質(zhì)粒表達載體      一、原核表達載體的表達元件      二、常用的原核表達載體      三、真核表達載體    第四節(jié)  噬菌體載體和柯斯質(zhì)粒載體      一、噬菌體載體      二、柯斯質(zhì)粒載體    本章問題  第四章  聚合酶鏈式反應(yīng)    第一節(jié)  PCR原理      一、常規(guī)PCR      二、定量PCR    第二節(jié)  PcR操作及引物設(shè)計      一、PCR的反應(yīng)體系      二、PCR擴增程序    第三節(jié)  引物設(shè)計原則及引物合成      一、引物設(shè)計原則      二、引物合成反應(yīng)    第四節(jié)  電泳分離及純化    本章問題  第五章  基因制備    第一節(jié)  直接分離基因      一、限制性內(nèi)切酶分離法      二、雙抗免疫分離法      三、根據(jù)蛋白質(zhì)克隆基因法      四、同源克隆法      五、T-DNA插入失活法    第二節(jié)  PCR法擴增基因      一、套式PCR      二、錨定PCR      三、長程PCR      四、反向PCR      五、逆轉(zhuǎn)錄PCR      六、易錯PCR      七、融合PCR    第三節(jié)  構(gòu)建基因組文庫法      一、基因組文庫及cDNA文庫概念      二、構(gòu)建基因組文庫的步驟      三、基因組文庫的質(zhì)量評價    第四節(jié)  噬菌體表面展示技術(shù)      一、噬菌體表面展示的概念      二、表面展示載體的原理      三、表面展示技術(shù)的不足      四、其他展示方法    第五節(jié)  酵母雙雜交技術(shù)      一、酵母雙雜交的概念      二、酵母雙雜交的原理      三、酵母雙雜交系統(tǒng)的組成      四、雙雜交的步驟    第六節(jié)  化學(xué)合成法      一、基因的化學(xué)合成      二、化學(xué)合成方法    本章問題  第六章  DNA重組及導(dǎo)入受體細胞    第一節(jié)  DNA重組      一、DNA的連接反應(yīng)      二、連接反應(yīng)的注意事項      三、平末端的連接    第二節(jié)  重組DNA導(dǎo)入原核生物      一、感受態(tài)細胞的制備及轉(zhuǎn)化      二、轉(zhuǎn)化子的檢測    第三節(jié)  重組DNA導(dǎo)入植物細胞      一、植物受體細胞類型及其特性      二、植物細胞的基因轉(zhuǎn)化方法      三、轉(zhuǎn)基因植物的篩選和鑒定    第四節(jié)  重組DNA導(dǎo)人動物細胞      一、動物細胞的特性      二、動物細胞的基因轉(zhuǎn)化方法    本章問題  第七章  外源基因的表達    第一節(jié)  外源基因在大腸桿菌中的表達      一、常見的大腸桿菌表達系統(tǒng)      二、外源基因在大腸桿菌中表達的形式      三、外源基因在大腸桿菌中高效表達的策略    第二節(jié)  外源基因在酵母中的表達      一、酵母表達載體的基本結(jié)構(gòu)      二、酵母表達系統(tǒng)的宿主      三、影響外源基因在酵母中表達的因素    本章問題  第八章  基因工程應(yīng)用及其安全性    第一節(jié)  基因工程藥物      一、基因工程激素類藥物      二、基因工程細胞因子類藥物      三、基因工程抗體      四、基因工程疫苗    第二節(jié)  轉(zhuǎn)基因植物      一、抗蟲害轉(zhuǎn)基因植物      二、抗病毒轉(zhuǎn)基因植物      三、抗逆轉(zhuǎn)基因植物      四、提高植物的品質(zhì)    第三節(jié)  轉(zhuǎn)基因動物      一、建立人類疾病的動物模型      二、作為生物反應(yīng)器      三、作為器官移植的動物供體      四、培育性狀優(yōu)良的家畜家禽      五、基因功能與調(diào)控的基礎(chǔ)研究    第四節(jié)  基因治療      一、基因治療的策略      二、基因治療的程序      三、遺傳病的基因治療      四、腫瘤的基因治療    第五節(jié)  基因芯片      一、基因芯片的定義及分類      二、基因芯片實驗基本流程      三、基因芯片的應(yīng)用    第六節(jié)  基因工程在分子改造中的應(yīng)用      一、在途徑工程中的應(yīng)用      二、在酶工程中的應(yīng)用    第七節(jié)  基因工程安全性      一、基因工程安全性問題的提出      二、基因工程不完善之處      三、基因工程安全性方面的政策法規(guī)      四、鼓勵研究的內(nèi)容    本章問題  附錄  基因工程復(fù)習(xí)一覽圖第二部分  基因工程實驗指導(dǎo)  第一章  實驗相關(guān)知識    第一節(jié)  前言    第二節(jié)  實驗操作技術(shù)路線    第三節(jié)  實驗報告的書寫  第二章  基因工程實驗原則  第三章  實驗內(nèi)容及操作方案    第一節(jié)  質(zhì)粒DNA的提取(實驗1)    第二節(jié)  PCR擴增木聚糖酶xyn，基因(實驗2)    第三節(jié)  瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)粒、分離目的基因(實驗3)    第四節(jié)  目的基因的回收及與T一載體的連接(實驗4)    第五節(jié)  感受態(tài)細胞的制備(實驗5)    第六節(jié)  重組DNA轉(zhuǎn)化受體細胞DH5α/JMl09(實驗6)    第七節(jié)  轉(zhuǎn)化子的篩選(實驗7)    第八節(jié)  基因的限制性內(nèi)切酶切割及與pET表達載體的連接(實驗8)    第九節(jié)  轉(zhuǎn)化BL21(DE3)受體細胞(實驗9)    第十節(jié)  外源蛋白的誘導(dǎo)表達(實驗10)    第十一節(jié)  SDS-PAGE檢測外源蛋白(實驗11)  第四章  基因工程操作中容易出現(xiàn)的錯誤及對策    第一節(jié)  基因工程中所用材料來源的問題    第二節(jié)  PCR擴增基因中的問題    第三節(jié)  質(zhì)粒提取中的問題    第四節(jié)  酶切過程中的問題    第五節(jié)  割膠回收基因中的問題    第六節(jié)  基因同載體連接中的問題    第七節(jié)  感受態(tài)細胞制備及轉(zhuǎn)化中出現(xiàn)的問題    第八節(jié)  陽性轉(zhuǎn)化子檢測中的問題    第九節(jié)  SDS-PAGE檢測外源蛋白中的問題附錄    一、密碼子偏好性    二、密碼子圖表    三、核酸、蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)換算參考文獻

章節(jié)摘錄

　　限制性內(nèi)切酶和連接酶是基因工程中關(guān)鍵的工具酶，它們使得基因的分離和連接得以實現(xiàn)。限制性內(nèi)切酶對DNA進行特異性切割，是獲取所需要基因片段的工具，可以將基因或DNA片段從染色體上剪切下來，進行體外基因重組。當(dāng)限制性內(nèi)切酶識別位點的中心軸兩側(cè)對稱切割DNA兩條鏈時，其產(chǎn)物會形成單鏈突出末端，即黏性末端。不同來源的DNA經(jīng)同一種限制酶切割后，其末端可以根據(jù)堿基互補匹配原則進行黏端配對?，F(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了很多限制性內(nèi)切酶，但是，仍然缺乏對于一些特殊識別序列切割的限制性內(nèi)切酶；此外，耐熱性限制性內(nèi)切酶、長識別序列的稀切酶仍然是當(dāng)前研究熱點。在連接酶的作用下，可將通過氫鍵結(jié)合在一起的DNA片段形成穩(wěn)定的化學(xué)鍵——磷酸二酯鍵，將兩條DNA連接起來，這種酶的作用可以形象稱為“縫線針”?，F(xiàn)在常用的連接酶有兩種：大腸桿菌連接酶和T4DNA連接酶，前者只能連接具黏性末端的DNA片段，后者可以連接黏性末端和平末端，連接效率更高一些?！　?.載體的研究　　體外重組DNA只有進入相應(yīng)細胞體內(nèi)，經(jīng)過復(fù)制擴增并表達相應(yīng)蛋白質(zhì)后，才能表現(xiàn)其生物學(xué)特征。重組DNA要進入受體細胞，必須有相應(yīng)的運載工具，載體就是基因的運載工具，它能夠攜帶DNA進入細胞并維持其復(fù)制、傳代、轉(zhuǎn)錄和翻譯過程。質(zhì)粒和病毒是兩類不同的載體系統(tǒng)，它們都具有復(fù)制功能，可以方便地將外源DNA導(dǎo)人宿主細胞并維持其復(fù)制，同時賦予宿主細胞新的表型特征。根據(jù)能否表達外源蛋白，可以將載體分為克隆載體和表達載體。根據(jù)適用的宿主細胞種類不同，可以將載體分為：細菌質(zhì)粒載體、噬菌體載體、酵母菌穿梭載體、植物克隆載體和動物克隆載體等。載體研究的目的是簡化基因操作程序，提高克隆或表達效率，推動基因工程研究的進程。

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