絲狀真菌分子細(xì)胞生物學(xué)與實(shí)驗(yàn)技術(shù)

前言

　　作為生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成部分，真菌在物質(zhì)循環(huán)和能量循環(huán)過(guò)程中都有重要的作用。雖然人類(lèi)對(duì)真菌的應(yīng)用歷史悠久，但直到最近人們才認(rèn)識(shí)到真菌是重要的生物資源，在醫(yī)藥、輕工、環(huán)保、食品、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，開(kāi)發(fā)前景非常廣闊。真菌是真核生物，具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、生活史短、易于培養(yǎng)的特點(diǎn)，使真菌成為研究真核生物的重要研究模式。近年來(lái)，以真菌為研究對(duì)象，以克隆和分析基因功能為目的的研究進(jìn)展非常迅速，極大地促進(jìn)了真菌分子細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展，在闡明細(xì)胞周期的調(diào)控、頂端生長(zhǎng)機(jī)制、細(xì)胞分化調(diào)節(jié)及真菌致病機(jī)制等生物學(xué)基本機(jī)制方面提供了很有意義的信息?！　‰m然許多真菌分子生物學(xué)的技術(shù)和原理與其他生物的分子生物學(xué)原理基本相同，但是，許多在動(dòng)物和植物等其他真核生物上應(yīng)用的方法技術(shù)，需要經(jīng)過(guò)一定的調(diào)整才能在真菌生物學(xué)研究中順利應(yīng)用。因此，真菌細(xì)胞分子生物學(xué)研究技術(shù)還是面臨許多挑戰(zhàn)。于是編者在幾年前便有了對(duì)應(yīng)用于真菌分子細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)與原理進(jìn)行匯集整理的想法，為高校開(kāi)展真菌學(xué)的教學(xué)和科研提供教材，同時(shí)也為從事真菌細(xì)胞分子生物學(xué)研究的科研工作者提供技術(shù)參考。　　在國(guó)家自然科學(xué)基金委杰出青年基金、水稻生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的支持、資助下，本書(shū)得以順利完成。編者在此表示感謝！同時(shí)，對(duì)關(guān)心、幫助過(guò)此書(shū)編寫(xiě)的專(zhuān)家、學(xué)者表示衷心感謝！　　本書(shū)將絲狀真菌研究領(lǐng)域中的分子細(xì)胞學(xué)研究技術(shù)進(jìn)行了總結(jié)，根據(jù)不同研究目的提供了可能的研究方案。本書(shū)可以作為高等院校和科研機(jī)構(gòu)的教材，也可以為環(huán)境、醫(yī)藥、生物資源、植物病理、微生物等領(lǐng)域的本科生、碩士和博士研究生及相關(guān)研究人員提供理論和實(shí)驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)。由于編者水平和條件的限制，不足之處在所難免，望多提寶貴建議。

內(nèi)容概要

真菌是真核生物的重要研究模式，廣泛應(yīng)用于真核細(xì)胞生命活動(dòng)機(jī)制的基礎(chǔ)研究中。真菌也是生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成部分，還是重要的生物資源，在醫(yī)藥、輕工、環(huán)保、食品、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，開(kāi)發(fā)前景廣闊。本書(shū)在總結(jié)近年來(lái)真菌分子細(xì)胞生物學(xué)研究的最新成果基礎(chǔ)上，著重介紹真菌分子細(xì)胞生物學(xué)研究中的常用技術(shù)，有針對(duì)性地提出了真菌分子細(xì)胞生物學(xué)研究的技術(shù)原理和方案。全書(shū)分為14章，主要內(nèi)容包括：真菌基因型的鑒定與特征分析、核酸的分析、真菌遺傳轉(zhuǎn)化、功能基因組學(xué)、生化與免疫方法、分子系統(tǒng)學(xué)及生物信息學(xué)常用軟件等。本書(shū)可以作為高等院校真菌學(xué)相關(guān)課程的教材，也可以作為高等院校和科研院所真菌研究者在分子細(xì)胞生物學(xué)研究方面的參考書(shū)。

書(shū)籍目錄

前言第一章  絲狀真菌基因型特征的鑒定  1  概述  2  基因組變異的主要特征  3  確定研究目的  4  用于基因組分析的技術(shù)  5  假設(shè)  6  選擇最佳策略    方案1  鏈格孢真菌的RAPD分析  7  AFLP技術(shù)的原理及其應(yīng)用    方案2  絲狀真菌的AFLP分析    方案3  絲狀真菌的cDNA-AFLP  8  變性梯度凝膠電泳(DGGE)    方案4  土壤中真菌的DGGE分析  9  重要的數(shù)據(jù)庫(kù)和互聯(lián)網(wǎng)資源第二章  絲狀真菌核酸的提取與分析  1  概述  2  基因組DNA的分離    方案1  CTAB法提取真菌基因組DNA    方案2  氯化芐(benzyl chloride)法提取真菌基因組DNA    方案3  絲狀真菌總DNA的分離    方案4  固體平板上菌小量DNA的塊速提取(以稻瘟病菌為例)    方案5  真菌小量DNA的快速提取  3  絲狀真菌RNA的提取  4  RNA的操作    方案6  Trizol法提取絲狀真菌總RNA    方案7  絲狀真菌總RNA的提取    方案8  真菌總RNA的小量提取(Trizol法)第三章  絲狀真菌的DNA轉(zhuǎn)化  1  概述  2  選擇性標(biāo)記和轉(zhuǎn)化載體  3  待轉(zhuǎn)化DNA的質(zhì)量  4  DNA的進(jìn)入  5  REMI轉(zhuǎn)化    方案1  稻瘟病菌(Maggna porthe grisea)原生質(zhì)體的制備及轉(zhuǎn)化    方案2  毛殼菌原生質(zhì)體的制備  6  真菌ATMT轉(zhuǎn)化    方案3  感受態(tài)農(nóng)桿菌細(xì)胞的制備與轉(zhuǎn)化    方案4  利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化真菌  7  電擊轉(zhuǎn)化    方案5  Tapesia yallundae的電擊轉(zhuǎn)化  8  轉(zhuǎn)化DNA的命運(yùn)    方案6  絲狀真菌中的質(zhì)粒拯救    方案7  農(nóng)桿菌電擊轉(zhuǎn)化感受態(tài)的制備與轉(zhuǎn)化第四章  絲狀真菌的遺傳分析  1  子囊菌遺傳分析    方案1  對(duì)真菌孢子進(jìn)行化學(xué)誘變    方案2  對(duì)真菌的孢子進(jìn)行紫外誘變    方案3  營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變體的篩選與鑒定    方案4  溫度敏感型突變?nèi)后w的制備    方案5  單孢分離    方案6  構(gòu)巢曲霉的八分體分析    方案7  通過(guò)準(zhǔn)性重配確定里連鎖群    方案8  稻瘟病菌溫度敏感型突變體的篩選  2  擔(dān)子菌遺傳分析    方案9  鬼傘菌在人工培養(yǎng)條件子實(shí)體和擔(dān)孢子的產(chǎn)生    方案10  通過(guò)CHEF凝膠電泳分離C.cinereus的染色體    方案11  C.cinereus的四分體分離    方案12  C.cinereus粉孢子的紫外誘變    方案13  利用NT、G(MNNG)/EMS對(duì)擔(dān)子菌進(jìn)行誘變    方案14  平板印跡    附：擔(dān)子菌研究中的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基第五章  絲狀真菌的基因組分析  1  概述  2  遺傳圖譜    方案1  克隆固定大小的基因組DNA作為RFLP探針    方案2  RAPD操作要點(diǎn)  3  電泳核型分析    方案3  瓊脂糖栓中制備完整染色體DNA    方案4  瓊脂糖栓電泳    方案5  鉗位均勻電場(chǎng)電泳  4  物理圖譜    方案6  染色體DNA的RecA-AC    方案7  準(zhǔn)備BAC載體DNA    方案8  準(zhǔn)備BAC插入DNA    方案9  BAC插入DNA大小的選擇，恢復(fù)和克隆    方案10  將文庫(kù)克隆排列到雜交膜上    方案11  收集克隆文庫(kù)  5  篩選文庫(kù)    方案12  Southern雜交分析混合文庫(kù)和克隆陣列文庫(kù)  6  染色體步移(chromosome walking)    方案13  BAC或者黏粒末端RNA探針的合成    方案14  根據(jù)插入片段末端序列制備的探針  7  真菌基因組分析相關(guān)數(shù)字資源第六章  真菌發(fā)育過(guò)程的細(xì)胞學(xué)分析  1  概述  2  絲狀真菌生長(zhǎng)的測(cè)定    方案1  菌絲頂端生長(zhǎng)的測(cè)定    方案2  菌落生長(zhǎng)速度的測(cè)定    方案3  直線(xiàn)生長(zhǎng)速率的測(cè)定  3  絲狀真菌孢子的萌發(fā)    方案4  真菌孢子的萌發(fā)測(cè)定  4  稻瘟病菌細(xì)胞生物學(xué)分析    方案5  稻瘟病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)、孢子收集和附著胞誘導(dǎo)培養(yǎng)    方案6  稻瘟病菌侵染過(guò)程的組織病理學(xué)觀(guān)察    方案7  稻瘟病菌孢子、附著胞內(nèi)脂質(zhì)體、糖原的觀(guān)察    方案8  細(xì)胞自噬現(xiàn)象的觀(guān)察    方案9  酒精氧化酶活性測(cè)定    方案10  冷凍替代用于電子顯微鏡觀(guān)察    方案11  細(xì)胞核，細(xì)胞壁和隔膜的染色第七章  絲狀真菌的信號(hào)傳導(dǎo)  1  概述  2  蛋白抽提    方案1  構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)蛋白激酶的抽提  3  蛋白免疫沉淀反應(yīng)    方案2  NIMA在大腸埃希菌(E.coli)中的表達(dá)和His-tag親和純化    方案3  蛋白質(zhì)免疫沉淀(IP)  4  凝膠阻滯試驗(yàn)(gel-shift assay)檢測(cè)蛋白的磷酸化狀態(tài)    方案4  NIMA磷酸化狀態(tài)的凝膠忸滯試驗(yàn)  5  蛋白激酶的底物特異性分析    方案5  NIMA激酶分析第八章  絲狀真菌的細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)  1  電子顯微鏡工作原理及其應(yīng)用  2  掃描電子顯微鏡樣品制備的原理與方法  3  透射電子顯微鏡樣品制備的原理與方法  4  電鏡細(xì)胞化學(xué)技術(shù)  5  免疫組化技術(shù)第九章  絲狀真菌的生化研究方法  1  概述  2  抽提物的準(zhǔn)備    方案1  菌絲的搖瓶培養(yǎng)    方案2  疏水蛋白的分離  3  細(xì)胞組分的準(zhǔn)備    方案3  細(xì)胞膜的分離    方案4  脈孢霉的液泡分離    方案5  線(xiàn)粒體的分離    方案6  細(xì)胞核的分離    方案7  細(xì)胞核的抽提    方案8  微體的分離  4  蛋白分析    方案9  孢子和菌絲的小量的蛋白質(zhì)抽提    方案10  從固體培養(yǎng)物中分離胞外酶(N.crassa的脂肪酶)    方案11  從新鮮菌絲分離細(xì)胞內(nèi)蛋白，適用于蛋白水解敏感蛋白的方法    方案12  從新鮮菌絲分離細(xì)胞內(nèi)蛋白    方案13  從凍干菌絲分離胞內(nèi)蛋白    方案14  酶學(xué)分析的代謝物抽提第十章  真菌研究中的免疫學(xué)方法  1  概述  2  免疫原分子的特性    方案1  免疫抗原的準(zhǔn)備  3  制備多克隆抗血清    方案2  用辛酸和硫酸銨沉淀法純化抗體    方案3  用ELISA測(cè)定pAb的滴度和檢驗(yàn)上清液中的mAb  4  制備單克隆抗體    方案4  通過(guò)B細(xì)胞-骨髓瘤細(xì)胞融合制取鼠科雜種瘤細(xì)胞    方案5  熒光免疫檢測(cè)    方案6  限制性稀釋法亞克隆    方案7  冷凍法長(zhǎng)期儲(chǔ)存的雜交瘤細(xì)胞    方案8  應(yīng)用抗原介導(dǎo)ELISA鑒定Ig類(lèi)別/亞類(lèi)  5  蛋白質(zhì)和糖類(lèi)抗原決定簇的特性    方案9  通過(guò)化學(xué)和酶學(xué)修飾確定的抗原決定簇的特性  6  其他經(jīng)常使用的免疫學(xué)分析方法    方案10  間接DAS-ELISA  7  抗體的提供及其商業(yè)發(fā)展第十一章  絲狀真菌的功能基因組分析  1  構(gòu)建稻瘟病菌突變子庫(kù)  2  目標(biāo)突變技術(shù)  3  cDNA文庫(kù)構(gòu)建及測(cè)序分析    方案1  構(gòu)建附著胞cDNA文庫(kù)的cDNA的合成  4  cDNA文庫(kù)構(gòu)建及篩選    方案2  cDNA文庫(kù)構(gòu)建    方案3  質(zhì)粒pTriplEx2的插入片段的驗(yàn)證  5  抑制差減雜交技術(shù)    方案4  稻瘟病菌附著胞SSF{差減文庫(kù)的構(gòu)建  6  絲狀真菌細(xì)胞自噬及其研究方法    方案5  稻瘟病菌中細(xì)胞自噬研究方法    方案6  稻瘟病菌細(xì)胞自噬研究中的其他相關(guān)顯微觀(guān)察    方案7  雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)    方案8  蛋白質(zhì)電泳(Tricine-SDS-PAGE)及蛋白質(zhì)印跡雜交    方案9  酵母雙雜交系統(tǒng)研究蛋白互作    方案10  細(xì)胞表達(dá)目的蛋白  7  真菌中結(jié)合PCR(Double-Joint PCR)基因融合片段操作  8  真菌RNAi技術(shù)的應(yīng)用第十二章  絲狀真菌分子進(jìn)化與系統(tǒng)發(fā)育分析  1  概述  2  系統(tǒng)發(fā)育分析方法    方案1  木霉菌的ITS rDNA的PCR擴(kuò)增    方案2  木霉菌的tef 1-α基因的PCR擴(kuò)增    方案3  木霉菌進(jìn)行RAPD研究    方案4  AFLP技術(shù)  3  構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)第十三章  絲狀真菌群體遺傳分析  1  純培養(yǎng)條件下真菌群體遺傳分析    方案1  Pot2-rep-PCR    方案2  MGR586-RFLP  2  免培養(yǎng)技術(shù)用于環(huán)境中真菌群體的遺傳結(jié)構(gòu)分析    方案3  土壤真菌DNA的直接提取    方案4  土壤樣品中真菌總DNA的提取第十四章  真菌分子生物信息學(xué)常用軟件的使用  1  概述  2  文件格式  3  FASTA格式  4  Tab(或其他分隔符)分隔的行文件  5  BLAST  6  Primer Premier 5  7  e-PCR  8  Clustal  9  BioEdit  10  Staden Package參考文獻(xiàn)

章節(jié)摘錄

　　組氨酸激酶的結(jié)構(gòu)與絲氨酸／蘇氨酸激酶或酪氨酸激酶的相關(guān)性不大。組氨酸激酶運(yùn)用一個(gè)磷酸基依賴(lài)系統(tǒng)將磷酸殘基從一個(gè)組氨酸磷酸化介體轉(zhuǎn)移到靶基質(zhì)是一個(gè)天冬氨酸殘基的氨基酸殘基上，因此，組氨酸激酶也稱(chēng)為雙組分系統(tǒng)。盡管雙組分信號(hào)系統(tǒng)是細(xì)菌對(duì)外界刺激發(fā)生反應(yīng)的主要機(jī)制，在真菌中這類(lèi)激酶家族并不是廣泛應(yīng)用的信號(hào)途徑，雖然一般認(rèn)為這個(gè)系統(tǒng)在調(diào)節(jié)滲透壓的過(guò)程中起作用。這樣，在真菌中，信號(hào)傳導(dǎo)途徑主要通過(guò)絲氨酸／蘇氨酸激酶介導(dǎo)?！　「鶕?jù)穩(wěn)定的和保守的蛋白殘基的特征，所有蛋白激酶的催化結(jié)構(gòu)域可以分為12個(gè)亞結(jié)構(gòu)域。而且，絲氨酸／蘇氨酸和酪氨酸激酶在其激酶結(jié)構(gòu)域中含有特異性的不同保守殘基。因此，一個(gè)不明的蛋白激酶根據(jù)其與已知蛋白酶的相似性，可以很確實(shí)的預(yù)測(cè)是絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶還是酪氨酸蛋白激酶。在結(jié)構(gòu)拓?fù)鋵W(xué)、調(diào)節(jié)及基物特異性方面，蛋白激酶催化結(jié)構(gòu)域的相似性已經(jīng)證明是很好的相似性指標(biāo)。這樣，對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)中已知蛋白激酶的快速的序列相似性檢索是一個(gè)界定真菌新蛋白激酶的很好的研究開(kāi)端。真菌信號(hào)傳導(dǎo)的主要研究?jī)?nèi)容是蛋白激酶的調(diào)節(jié)功能。本章節(jié)主要描述應(yīng)用于絲狀真菌蛋白激酶的實(shí)驗(yàn)方法?！　? 蛋白抽提　　蛋白激酶通過(guò)調(diào)節(jié)激酶的磷酸化狀態(tài)，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的生理功能，在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中起著關(guān)鍵的作用。蛋白激酶的磷酸化可以使蛋白處于活化或抑制狀態(tài)。因此，激酶抽提過(guò)程中需要保持蛋白的磷酸化狀態(tài)，提取使用的緩沖液應(yīng)該包含有蛋白磷酸酶抑制劑。

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