蛋白質(zhì)組學(xué)中的蛋白質(zhì)純化手冊(cè)

前言

　　隨著各種基因組序列計(jì)劃的成功完成，包括人類基因組在內(nèi)的150多個(gè)已公開的基因組計(jì)劃，生物學(xué)家現(xiàn)在關(guān)注更多的是各個(gè)基因組中編碼蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，試圖確定基因的真正功能。由于此領(lǐng)域的興趣不斷增長(zhǎng)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社（ColdSpring Harbor Laboratory Press）于2003年出版了《蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》（Proteins and Proteomics：A Laboratory Manual）一書，全面介紹了各種蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法，包括蛋白質(zhì)分離，特別是單向凝膠和雙向凝膠（2D膠）的方法，以及經(jīng)典的“pull-down”技術(shù)，即用親和標(biāo)簽來分離蛋白質(zhì)及其相互作用配體。此書還包括如何用傳統(tǒng)的氨基末端和羧基末端序列分析以及質(zhì)譜方法，來鑒定通過這些手段分離出來的蛋白質(zhì)（包括翻譯后修飾，特別是磷酸化位點(diǎn)）?！　‖F(xiàn)在，蛋白質(zhì)組學(xué)這一領(lǐng)域剛開始趨于成熟，很明顯，除了傳統(tǒng)的單向凝膠和雙向凝膠方法外，蛋白質(zhì)組研究中還需要其他分離工具，特別是要想了解那些珍貴而又稀少的蛋白質(zhì)時(shí)。對(duì)一些與疾病有關(guān)的低豐度生物標(biāo)記物和某些難以用2D膠處理的蛋白質(zhì)（如膜蛋白）更是如此。例如，大多數(shù)用2D膠獲得的蛋白質(zhì)表達(dá)譜實(shí)驗(yàn)中，只有在細(xì)胞或組織中分布量大的蛋白質(zhì)（如管家蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白）才可以觀察到。一個(gè)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的分布動(dòng)態(tài)范圍是105～106數(shù)量級(jí)。例如，肌動(dòng)蛋白（細(xì)胞中分布最為廣泛的蛋白質(zhì)）在每個(gè)細(xì)胞內(nèi)的濃度為10。個(gè)分子，而某些細(xì)胞受體或轉(zhuǎn)錄因子在每個(gè)細(xì)胞內(nèi)只有102～10。個(gè)分子。當(dāng)研究像血液這樣的生物樣本時(shí)，這個(gè)問題就更明顯了，血清白蛋白以40mg／ml的量存在，細(xì)胞因子則以低達(dá)pg／ml的量存在，蛋白質(zhì)分布的動(dòng)態(tài)范圍約為109。因?yàn)?D膠上能檢測(cè)到的蛋白質(zhì)的動(dòng)態(tài)范圍約為104，如果結(jié)合某些預(yù)分級(jí)分離技術(shù)是可以去除高豐度蛋白的，使感興趣的低豐度蛋白能分離出來?！　　兜鞍踪|(zhì)組學(xué)中的蛋白質(zhì)純化手冊(cè)》作為《蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》的姊妹篇，其目的是為研究者提供重要的純化策略（第1部分）、預(yù)分級(jí)分離的方法一一色譜（第Ⅱ部分）和電泳（第Ⅲ部分），以避開動(dòng)態(tài)范圍的限制。除了這些預(yù)分級(jí)分離方法外，本書還涵蓋了許多經(jīng)典的蛋白質(zhì)分離方法。這些方法可用來進(jìn)行高分辨率三維結(jié)構(gòu)分析，即以結(jié)構(gòu)基因組學(xué)（也被稱為結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)）和蛋白質(zhì)微陣（蛋白質(zhì)芯片）分析為目的的高通量制備純化蛋白質(zhì)。此外，第1V部分介紹了測(cè)定純化蛋白-功能完整性的方法（如構(gòu)象穩(wěn)定性、精確分子質(zhì)量，聚合狀態(tài)的測(cè)定以及用表面等離子體共振測(cè)定結(jié)合特性），還描述了糖蛋白中糖的分析；提供的實(shí)驗(yàn)方案詳述了如何從糖蛋白中除去聚糖和制備單糖用于GC-MS鑒定。

內(nèi)容概要

蛋白質(zhì)組學(xué)這一領(lǐng)域剛開始趨于成熟，而開展蛋白質(zhì)組學(xué)研究首先要把蛋白質(zhì)從復(fù)雜的大分子混合物中分離純化出來。為此，需要經(jīng)過驗(yàn)證并值得信賴的蛋白質(zhì)分離純化方案以用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究。    原著“Purifying Protein s for Proteomics：A Laboratory Manual”由國(guó)際權(quán)威專家Richa rd J．Simpson聯(lián)合全球知名的專業(yè)實(shí)驗(yàn)室共同撰寫，著名的美國(guó)冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory P ress)推出，是《蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》的姐妹篇。    以蛋白質(zhì)組學(xué)中的蛋白質(zhì)純化為核心。本書的主要內(nèi)容有：    ★蛋白質(zhì)純化和蛋白質(zhì)組學(xué)的各種實(shí)用技術(shù)。包括專門用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究的制備技術(shù)、色譜方法和電泳技術(shù)，用于結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)研究的蛋白質(zhì)純化分析技術(shù)等    ★上述各種技術(shù)方法的背景資料、理論、實(shí)驗(yàn)方案、疑難解答以及相關(guān)的支持性信息和參考資料    本書盡可能完全地羅列了各種實(shí)驗(yàn)方案，可供不同規(guī)模實(shí)驗(yàn)室的研究者選擇應(yīng)用。在介紹每一個(gè)實(shí)驗(yàn)方案時(shí)，以“step-by-step”操作指南的形式逐步展開，詳細(xì)列出實(shí)驗(yàn)儀器、試劑及操作步驟，并針對(duì)常見問題給出經(jīng)驗(yàn)性的提示或解決方案。    毫無疑問，對(duì)于蛋白質(zhì)化學(xué)、生物化學(xué)的研究人員在蛋白質(zhì)組學(xué)這一新興領(lǐng)域?qū)で笞钚碌募夹g(shù)方法，本書是一部必備的實(shí)驗(yàn)指南。而對(duì)于遺傳學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)研究人員開展表型和細(xì)胞功能研究，以及醫(yī)學(xué)和生物工程領(lǐng)域開展蛋白質(zhì)相關(guān)研究，本書也是基本的實(shí)驗(yàn)工具書。

書籍目錄

第Ⅰ部分：供蛋白質(zhì)組學(xué)分析的蛋白樣品制備　第1章　分離科學(xué)在蛋白質(zhì)組學(xué)中的作用　第2章　蛋白質(zhì)的純化策略第Ⅱ部分：蛋白質(zhì)組學(xué)中制備蛋白樣品的色譜方法　第3章　蛋白質(zhì)和肽純化的色譜方法導(dǎo)論　第4章　全蛋白的多維色譜　第5章　可溶性重組蛋白的高通量篩選　第6章　離子交換色譜　第7章　尺寸排阻色譜　第8章　反相高效液相色譜在蛋白質(zhì)分離和純化中的應(yīng)用　第9章　疏水相互作用色譜　第10章　親和色譜與免疫親和色譜　第11章　蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的染料配基親和色譜　第12章　固定化金屬離子親和色譜　第13章　用羥磷灰石進(jìn)行蛋白質(zhì)色譜　第14章　色譜聚焦第Ⅲ部分：蛋白質(zhì)組學(xué)中制備蛋白樣品的電泳方法　第15章　電泳分離蛋白質(zhì)策略導(dǎo)論　第16章　雙向凝膠電泳分離蛋白質(zhì)　第17章　在MCE中通過等電位分段法進(jìn)行高分辨率雙向凝膠電泳來制備樣品　第18章　一種電泳純化蛋白質(zhì)的方法：Gradiflow　BF400儀　第19章　用自由流動(dòng)電泳技術(shù)純化蛋白質(zhì)第Ⅳ部分：用于結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)的純化蛋白的分析　第20章　已純化蛋白質(zhì)鑒定方法導(dǎo)論　第21章　用質(zhì)譜測(cè)定蛋白質(zhì)的特性　第22章　分析超速離心：蛋白質(zhì)大小、構(gòu)象和相互作用　第23章　蛋白質(zhì)構(gòu)象穩(wěn)定性的測(cè)定　第24章　表面等離子體共振與質(zhì)譜聯(lián)用：鑒定結(jié)合配體及描述相互作用　第25章　糖蛋白中糖的分析　附錄1　蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)概述　附錄2　蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定　附錄3　蛋白質(zhì)溶液的濃縮　附錄4　蛋白質(zhì)的儲(chǔ)存穩(wěn)定性　附錄5　單向聚丙烯酰胺凝膠電泳　附錄6　疑難問題解決指南　附錄7　注意事項(xiàng)　索引

章節(jié)摘錄

　　如果一個(gè)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)不能從其氨基酸序列來得以精確的預(yù)測(cè)，那么，我們?nèi)绾文茉谝欢ㄋ缴纤阉鞯接嘘P(guān)其功能方面的詳細(xì)知識(shí)呢？在不久的將來，至少能通過下面的方式得到答案，即將目的蛋白純化到足夠程度并獲得足夠量，以允許對(duì)其生物化學(xué)和結(jié)構(gòu)進(jìn)行精細(xì)的分析。如果研究者有一個(gè)好的純化方案可以遵循，那是非常幸運(yùn)的。事實(shí)上，更多的時(shí)候不是這樣的，而是要修改已有的純化方案，甚至要重新做一個(gè)方案。本章概述了在設(shè)計(jì)純化方案時(shí)需要考慮的因素以及在蛋白質(zhì)純化中某些新的和令人振奮的發(fā)展。各種蛋白質(zhì)分離形式的理論和應(yīng)用細(xì)節(jié)將在后面的章節(jié)中敘述?！　∪绻紤]到生物基質(zhì)（如細(xì)胞或組織提取物）中存在復(fù)雜的大分子混合物時(shí)，那么蛋白質(zhì)純化面臨的挑戰(zhàn)就不言而喻了。由雙向凝膠電泳獲得的人上皮細(xì)胞蛋白質(zhì)譜（表達(dá)譜）就證明了這種復(fù)雜性（圖2.1）。在特定的細(xì)胞中，除感興趣的蛋白質(zhì)（目的蛋白）外，還存在幾千種具有不同性質(zhì)的其他蛋白質(zhì)（保守估計(jì)為5000～8000種），連同一起的還有非蛋白質(zhì)物質(zhì)，如DNA、RNA、多糖和脂類。即使是蛋白質(zhì)，它們?cè)诩?xì)胞中的量也不同。某種高豐度的細(xì)胞骨架蛋白（如肌動(dòng)蛋白）在細(xì)胞提取物中可能占到蛋白質(zhì)總量的10％。另一種極端的例子是某種稀少的轉(zhuǎn)錄因子可能以非常低的水平（

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