真核生物轉(zhuǎn)錄調(diào)控

內(nèi)容概要

真核生物轉(zhuǎn)錄調(diào)控：概念、策略與技術(shù)（第二版）是美國(guó)冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社出版的《真核生物轉(zhuǎn)錄調(diào)控——概念、策略與技術(shù)》（第二版）一書的中譯本。書中全面介紹了真核基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的概念，以及進(jìn)行研究所使用的策略和技術(shù)。涉及內(nèi)容包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控入門知識(shí)、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的兩個(gè)重要角色——DNA元件和蛋白質(zhì)組分的鑒定及功能表征，以及兩者間復(fù)雜的相互作用構(gòu)成的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的重要事件和這些事件發(fā)生的染色質(zhì)環(huán)境。
真核生物轉(zhuǎn)錄調(diào)控：概念、策略與技術(shù)（第二版）概括了真核基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的基本概念、實(shí)施轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究的基本策略，以及實(shí)現(xiàn)研究目標(biāo)的重要技術(shù)。因此，真核生物轉(zhuǎn)錄調(diào)控：概念、策略與技術(shù)（第二版）對(duì)于醫(yī)學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)、生物技術(shù)等領(lǐng)域中對(duì)基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控感興趣或從事相關(guān)研究的學(xué)生、教學(xué)科研人員和技術(shù)人員是一本重要讀物。

書籍目錄

譯者序前言概述縮略詞1 哺乳動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控入門引言和概述全基因組方法小結(jié)染色質(zhì)和通用轉(zhuǎn)錄機(jī)器染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和組織染色質(zhì)修飾染色質(zhì)重塑通用轉(zhuǎn)錄機(jī)器調(diào)控區(qū)的組織基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的組裝和起始調(diào)解因子TFIID和TAF活化和抑制基因活化轉(zhuǎn)錄起始期間的染色質(zhì)修飾和重塑通用機(jī)器募集的一種模式聚合酶II延伸的初始階段聚合酶II在基因內(nèi)遭遇核小體轉(zhuǎn)錄的沉默或抑制結(jié)語參考文獻(xiàn)2 初始策略性問題引言和概述實(shí)驗(yàn)策略新轉(zhuǎn)錄因子的表征方法分析新基因的調(diào)控專題2.1 核連綴轉(zhuǎn)錄分析考慮達(dá)到明確目標(biāo)所需的時(shí)間投入和資源確定項(xiàng)目目標(biāo)評(píng)估分析的可行性啟動(dòng)對(duì)新基因的綜合轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析技術(shù)方案2.1 核連綴分析參考文獻(xiàn)3 轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的定位引言和概述實(shí)驗(yàn)策略初步考慮快速擴(kuò)增cDNA末端(RACE)專題3.1 帽子依賴性RACE程序引物延伸專題3.2 引物延伸RNase保護(hù)法專題3.3 RNase保護(hù)S1核酸酶分析專題3.4 核酸酶保護(hù)專題3.5 核酸酶保護(hù)技術(shù)方案3.1 引物延伸分析方案3.2 RNase保護(hù)分析參考文獻(xiàn)4 啟動(dòng)子分析的功能性分析方法引言和概述實(shí)驗(yàn)策略選擇分析方法:各種分析方法的優(yōu)缺點(diǎn)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染分析專題4.1 常用的轉(zhuǎn)染方法專題4.2 螢光素酶報(bào)告基因分析專題4.3 CAT報(bào)告基因分析專題4.4 LacZ、SEAP和GFP報(bào)告基因分析法專題4.5 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的分離通過染色體整合的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染分析專題4.6 有復(fù)制能力的載體技術(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的常用轉(zhuǎn)染方法方案4.1 3T3成纖維細(xì)胞的磷酸鈣轉(zhuǎn)染方案4.2 淋巴細(xì)胞系的DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染方案4.3 RAW264.7巨噬細(xì)胞的電穿孔轉(zhuǎn)染方案4.1~4.3的附加說明方案4.4 螢光素酶分析方案4.5 氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶分析方案4.6 β-半乳糖苷酶分析參考文獻(xiàn)5 遠(yuǎn)程控制區(qū)的鑒定和分析引言和概述專題5.1 DNase I高敏感性分析實(shí)驗(yàn)策略DNase I高敏感性基質(zhì)附著區(qū)的鑒定專題5.2 鑒定MAR的方法鑒定遠(yuǎn)程控制區(qū)的功能性方法表征遠(yuǎn)程控制區(qū)的功能性分析方法參考文獻(xiàn)6 鑒定控制區(qū)內(nèi)的順式作用DNA元件引言和概述實(shí)驗(yàn)策略通過綜合性突變體分析鑒定控制元件綜合性分析的策略來自綜合性突變體分析與系統(tǒng)發(fā)生分析比較的深刻見解參考文獻(xiàn)7 鑒定DNA結(jié)合蛋白及其基因引言和概述鑒定DNA結(jié)合蛋白的實(shí)驗(yàn)策略數(shù)據(jù)庫方法用于粗制細(xì)胞裂解物的蛋白質(zhì)-DNA相互作用分析方法的發(fā)展專題7.1 假設(shè)EMSA結(jié)果克隆和鑒定編碼DNA結(jié)合蛋白基因的實(shí)驗(yàn)策略專題7.2 通過蛋白質(zhì)純化克隆通過蛋白質(zhì)純化和肽序列分析進(jìn)行克隆其他克隆方法參考文獻(xiàn)8 確認(rèn)蛋白質(zhì)-DNA相互作用的功能相關(guān)性引言和概述實(shí)驗(yàn)策略染色質(zhì)免疫沉淀通過基因破壞或RNA干擾的功能缺失研究體外蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物的豐度DNA結(jié)合蛋白和靶基因的相對(duì)表達(dá)模式蛋白質(zhì)結(jié)合所需核苷酸和調(diào)控元件活性所需核苷酸之間的相關(guān)性DNA結(jié)合蛋白的過量表達(dá)對(duì)報(bào)告基因或內(nèi)源基因的反式激活與相鄰控制元件結(jié)合的蛋白質(zhì)間的協(xié)作結(jié)合和協(xié)同效應(yīng)基因組足跡模式和體外足跡模式的比較蛋白質(zhì)-DNA相互作用的相對(duì)親和力顯性失活突變體體外轉(zhuǎn)錄策略改變特異性實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)9 內(nèi)源性控制區(qū)的體內(nèi)分析引言和概述實(shí)驗(yàn)策略染色質(zhì)免疫沉淀DamIDDNase I和DMS基因組足跡專題9.1 連接介導(dǎo)PCR高錳酸鉀基因組足跡核小體存在和定位的Southern印跡分析專題9.2 通過MNase-Southern印跡分析進(jìn)行核小體定位的低分辨率分析監(jiān)測(cè)核小體存在和定位的LM-PCR、PCR及ChIP策略用于分析核小體重塑的體內(nèi)方法的概述DNase I高敏感性監(jiān)測(cè)核小體重塑用于監(jiān)測(cè)核小體重塑的MNase方法限制性內(nèi)切核酸酶可及性分析專題9.3 限制性內(nèi)切核酸酶可及性-LM-PCR分析染色質(zhì)構(gòu)象捕獲DNA甲基化技術(shù)方案9.1 MNase-Southern印跡分析方案9.2 LM-PCR方法方案9.3 染色質(zhì)免疫沉淀參考文獻(xiàn)10 鑒定和表征轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的結(jié)構(gòu)域引言和概述實(shí)驗(yàn)策略:定義結(jié)構(gòu)域功能結(jié)構(gòu)域的鑒定專題10.1 結(jié)構(gòu)域的計(jì)算分析基本突變?cè)韺ｎ}10.2 表達(dá)系統(tǒng)專題10.3 標(biāo)簽識(shí)別與檢測(cè)的通用方法序列特異性調(diào)控因子的結(jié)構(gòu)域分離序列特異性調(diào)控因子的DNA結(jié)合和激活/抑制結(jié)構(gòu)域?qū)ｎ}10.4 VP16激活結(jié)構(gòu)域:個(gè)案研究專題10.5 GAL4:個(gè)案研究專題10.6 KRAB抑制結(jié)構(gòu)域:個(gè)案研究細(xì)分DNA識(shí)別亞結(jié)構(gòu)域和寡聚化亞結(jié)構(gòu)域概念和策略: 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用共激活因子和共抑制因子的分離及克隆研究激活結(jié)構(gòu)域與共激活因子相互作用的方法通過親和層析研究激活/抑制結(jié)構(gòu)域與其靶標(biāo)之間的相互作用改變特異性遺傳系統(tǒng)通用轉(zhuǎn)錄機(jī)器的結(jié)構(gòu)-功能分析共激活因子的分析技術(shù)方案10.1 PCR介導(dǎo)的定點(diǎn)突變參考文獻(xiàn)11 DNA的調(diào)控性轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合引言和概述實(shí)驗(yàn)策略DNA-蛋白質(zhì)相互作用的一般理論和實(shí)例專題11.1 Kd情況的例子DNA-蛋白質(zhì)相互作用的分析及建模專題11.2 SAAB分析專題11.3 DNase I足跡和外切核酸酶足跡專題11.4 用于小溝相互作用的化學(xué)探針啟動(dòng)子特異性多組分核蛋白復(fù)合物的分析技術(shù)方案11.1 DNase I足跡方案11.2 羥自由基足跡方案11.3 磷酸乙基化干擾分析方案11.4 甲基化干擾分析方案11.5 電泳遷移率變動(dòng)分析方案11.6 32P末端標(biāo)記DNA片段的準(zhǔn)備參考文獻(xiàn)12 體外轉(zhuǎn)錄和起始前復(fù)合物組裝引言和概述實(shí)驗(yàn)策略提取物的制備轉(zhuǎn)錄分析專題12.1 測(cè)定體外轉(zhuǎn)錄的方法分級(jí)分離的系統(tǒng)專題12.2 純化的轉(zhuǎn)錄因子基本起始前復(fù)合物的形成開放復(fù)合物的形成、起始和啟動(dòng)子逃脫活化復(fù)合物在啟動(dòng)子上的組裝技術(shù)核提取物制備:概述方案12.1 Dignam和Roeder核提取物方案12.2 使用HeLa細(xì)胞提取物和引物延伸的體外轉(zhuǎn)錄方案12.3 使用HeLa細(xì)胞核提取物的無G序列盒體外轉(zhuǎn)錄共激活因子的純化(方案12.4和方案12.5)方案12.4 表位標(biāo)記TFIID的純化方案12.5 從表達(dá)FLAG標(biāo)記調(diào)解因子亞基的HeLa細(xì)胞系中純化調(diào)解因子方案12.6 固定化模板分析方案12.7 Pol II開放復(fù)合物的高錳酸鉀探測(cè)方案12.8 DNA結(jié)合TFIID的鎂-瓊脂糖EMSA參考文獻(xiàn)13 體外研究染色質(zhì)動(dòng)力學(xué):染色質(zhì)組裝、重塑和轉(zhuǎn)錄引言和概述實(shí)驗(yàn)策略用于組裝染色質(zhì)的策略專題13.1 DNA模板和重建方法對(duì)陣列內(nèi)核小體定位的影響組蛋白來源染色質(zhì)重建的生化表征專題13.2 核小體陣列的MNase分析專題13.3 核小體陣列的EcoRI酶切分析體外測(cè)驗(yàn)組蛋白修飾作用策略染色質(zhì)重塑/修飾酶的分析以染色質(zhì)模板進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄技術(shù)方案13.1 雞紅細(xì)胞組蛋白八聚體制備方案13.2 核小體的鹽梯度透析重建方案13.3 利用重組的果蠅ACF和NAP1重建核小體陣列參考文獻(xiàn)附錄:注意事項(xiàng)索引

章節(jié)摘錄

　　通過分析用特定報(bào)告質(zhì)粒得到的數(shù)個(gè)獨(dú)立克隆，可以獲得所得到的活性范圍和平均活性的相關(guān)知識(shí)。當(dāng)嘗試比較控制區(qū)在不同細(xì)胞系中的活性，或嘗試比較野生型控制區(qū)和突變型控制區(qū)時(shí)，這一信息非常有價(jià)值?？寺∨c克隆之間的變異性使這些對(duì)比難以進(jìn)行，但是，如果知道了變異性的程度就能很有幫助。如果目的是監(jiān)測(cè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞中特定控制區(qū)的誘導(dǎo)活性，那么分離和分析單個(gè)細(xì)胞克隆就同樣重要，這是因?yàn)檎衔稽c(diǎn)會(huì)影響誘導(dǎo)的程度?！　》治黾?xì)胞克隆。盡管對(duì)幾個(gè)不同克隆的分析是有價(jià)值的，但是在多數(shù)情況下，沒有必要嚴(yán)格地確定每個(gè)假定克隆都確實(shí)是克隆的。如果96孔板上的一小部分孔中含有抗藥性群落，那么每個(gè)群落就可能是克隆的。對(duì)于某些實(shí)驗(yàn)，明確地確定每個(gè)群落都是克隆的（通過極限稀釋對(duì)細(xì)胞進(jìn)一步亞克隆，以及通過Southern印跡分析確定整合位點(diǎn)）可能很重要。然而，因?yàn)閹讉€(gè)細(xì)胞克隆將會(huì)被比較，并且預(yù)計(jì)由于整合位點(diǎn)的差異有相當(dāng)大的變化，因此某些樣品的寡克隆一般不會(huì)產(chǎn)生大的影響?？截悢?shù)的嚴(yán)格確定（通過定量的Southern印跡或?qū)崟r(shí)PCR）也可能沒有必要，除非需要精確確定以單個(gè)克隆觀察到的變化中有多少變化歸因于拷貝數(shù)的變化，而又有多少變化歸因于整合位點(diǎn)的變化。在某些情況下，該信息是有用的，如確定一個(gè)控制元件是否符合LCR的定義。然而，對(duì)于大多數(shù)基因調(diào)控研究來說，該信息價(jià)值有限?！　》治黾?xì)胞池。分離幾個(gè)單個(gè)克隆的替代方法是比較幾個(gè)獨(dú)立的細(xì)胞池，這一策略的潛在優(yōu)勢(shì)是由整合位點(diǎn)和拷貝數(shù)的差異造成的各池中的變異可被平均，從而減小池間的差異；其缺點(diǎn)是如果一個(gè)或少數(shù)克隆表現(xiàn)出由報(bào)告基因或抗藥性基因的整合位點(diǎn)或表達(dá)水平造成的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，池中每個(gè)克隆的相對(duì)豐度會(huì)隨時(shí)間劇烈變化。其實(shí)，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞池可以非常迅速地成為寡克隆或單克隆。因此，不能假定對(duì)細(xì)胞池的分析可以產(chǎn)生對(duì)許多克隆系進(jìn)行單獨(dú)分析時(shí)獲得的平均結(jié)果。而且，在某一時(shí)刻以細(xì)胞池獲得的結(jié)果可能不同于將細(xì)胞傳代數(shù)周后獲得的結(jié)果，這是因?yàn)榧?xì)胞的選擇性過度生長(zhǎng)十分常見。因此，需要注意的是，相對(duì)于當(dāng)分離了單個(gè)克隆時(shí)檢驗(yàn)的數(shù)目，細(xì)胞池的使用不能減少以每個(gè)報(bào)告質(zhì)粒所需檢驗(yàn)的樣品數(shù)目。雖然細(xì)胞池的使用理論上可產(chǎn)生來自大量單個(gè)克隆的平均報(bào)告基因信號(hào)，但是一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)克隆選擇性過度生長(zhǎng)的可能性使得對(duì)幾個(gè)細(xì)胞池進(jìn)行檢驗(yàn)成為必要。對(duì)照及結(jié)果的解釋　　穩(wěn)定轉(zhuǎn)染分析中，需要用對(duì)照確證啟動(dòng)子受到正確調(diào)控。如果啟動(dòng)子預(yù)期是細(xì)胞類型特異性的，那么用不同細(xì)胞系進(jìn)行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)就可以確定這一點(diǎn)。正如瞬時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，用病毒啟動(dòng)子／增強(qiáng)子驅(qū)動(dòng)的報(bào)告基因進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)，將有利于對(duì)從不同細(xì)胞系獲得的結(jié)果進(jìn)行歸一化處理。　　……

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